植物组织培养教案——原生质体分离.docVIP

植物组织培养教案原生质体分离? ??????????? 课程__植物组织培养__????? 200 /200? 学年第_ __学期???????????? 教师______ ??? 授课日期 ? ? ? ? ? ? 班??? 级 ? ? ? ? ? ? ? ? 课??? 题：????????????? ?原生质体分离 ? ?教学目标：了解原生质体培养及融合培养的意义；掌握原生质体分离的大致步骤； ? ?重点难点：原生质体分离的方法与步骤 ? ?教学方法：课堂讲授 ? ?教??? 具：多媒体教学 ?? ?教学参考书：《植物组织培养》 ? 课后作业：1、分离时用哪些酶，各有何作用? 2、怎样对分离粗液进行培养? 3、原生质体分离的方法有那些？ ? ? ? 教学札记： ? ? ? ? ? ? ??????????????????????????????????????????????????????????????? ?编写日期： ? 教案附页 ? 一、原生质体培养发展简史及其意义 1、发展简史 ??? 原生质体(protoplast)是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有全能性，可以经过离体培养得到再生植株。原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、茄子、番茄等70种植物的原生质体再生成完整的植株。此外，原生质体融合，体细胞杂交的技术也得到广泛的应用。??? 1993年有49个科、146个属的320多种植物，经原生质体培养得到了再生植株。其趋势主要是农作物和经济植物，从一年生扩展到多年生，从草本到木本、从高等植物到低等植物，食用菌、藻类、大豆、棉花、油菜、水稻、玉米、柑桔、猕猴桃、桃、苹果、马铃薯、胡萝卜、黄瓜、杨树、云杉等； 2、原生质体培养的意义（1）为细胞融合奠定基础 （2）是遗传工程的理想受体???? 能够直接摄取外源DNA，细胞器甚至微生物 （3）种质资源保存 （3）理论基础研究 （二）原生质体分离及培养 1、? 分离方法 有机械法（利刃机械切割）和酶解法；但目前普遍采用酶分离法来获得原生质体。 1）植物材料??? 一般来说，植物各个器官，如：根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。 （1）.细胞悬浮培养物? 是最常采用的作为分离原生质体的材料??? 在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织。即取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在26黑暗条件下，在含2，4-D2~4mg／L的MS固体培养基上，诱导愈伤组织，每隔2~4d转接一次。从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到液体培养基的l00ml三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋转式振荡器，速度控制在80~120r／min，在25土1下暗培养。悬浮培养初期应每隔3d继代一次，一个半月后，吸取4~5ml悬浮细胞转到250ml三角瓶的40ml新鲜培养中，以后每隔7d继代一次。通常经悬浮培养3~4月后，悬浮培养细胞的大小变得较为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。 ?（2）.叶肉细胞? 叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料??? 用叶片的薄壁组织作为材料来源，既要考虑植株的生长环境，又要考虑叶片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。取生理状态适宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。要获得良好的培养材料，下列外界因素是考虑的重要因子：光强为3000-6000Lx、温度为20~25培养、相对湿度在60％~80％左右。??2）植物材料的预处理??? 对原生质体材料进行预处理是将材料放置于合适浓度的稳压液中使细胞质壁分离以提高原生质体的分离频率；也可以逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。这些处理包括：暗处理、预培养、低温处理等。把豌豆的枝条取下后，在分离原生质体前，先让材料在黑暗中的一定湿度条件下放1~2d，这样得到的原生质体存活率高，并能继续分裂；在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先去掉叶片的下表皮，