中国生命科学论坛精华--PCR专题-生物谷.PDFVIP

中国生命科学论坛精华帖之—— PCR 专 题 （1） PCR的问题，无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题。今天我们把相关内容整理出来， 与大家共同讨论，希望对大家能有所帮助。同时欢迎您来到做进一 步的讨论。 一、 引物设计 所谓“工欲善其事，必先利其器”，这年头手工设计引物的人似乎不多，还是用软件方 便些，防止你一不小心看走眼，丢一个碱基，同时计算起来也方便。设计软件有很多，既可 以在线设计（如Primer3 /cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi），也可以用 Primer5 、Oligo6.65 等等。到哪找？别着急，咱论坛里有，用起来有什么问题也可以到论坛 里问问： Primer5 ：/dispbbs.asp?boardID=25ID=38536 Oligo6.67 ：/dispbbs.asp?boardID=25ID=40898 有了软件就该讲讲怎么设计了： 1. 引物设计的原则 细心地进行引物设计是PCR 中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一 序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同时扩增其他的非目的序列。下面的指导描 述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： 1. 典型的引物 18 到24 个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存 在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。较 长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产 量。 2. 选择GC 含量为40 ％到60 ％或GC 含量与模板GC 含量接近的引物。 3. 设计5端和中间区为G 或C 的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交 的稳定性。 4. 避免引物对 3末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。 在用软件设计时大家常常会疑惑,究竟 ? G 不能低于多少?这里有个数据: ? G 为 0~-2 时,PCR 产率可达 100%, ? G=-6 时,为40%. 5. 避免3末端富含GC 。设计引物时保证在最后5 个核苷中含有 3 个A 或T 。 6. 避免3末端的错误配对。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。3’最好以G 或C 结尾，防止AT 的松散结合引起错配。 7. 避免存在可能会产生内部二级结构如发夹结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。 8. 引物的一个重要参数是熔解温度（Tm ）。这是当 50 ％的引物和互补序列表现为双链 DNA 分子时的温度。两引物的Tm 值相差不应大于5℃。计算Tm 有几种公式。第一个公式 (Wallace 规则):Tm = 4 ℃（g + C ） +2 ℃（a + T ）,这来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于 15-20 个碱基的引物,也适用于手工设计时的简单计算。第二个公式(Baldino 算法)适用于计算 14-70 个核苷酸在≤0.4mol\L 的阳离子溶液中的 Tm, 也可用于扩增产物的 Tm 计算. + Tm=81.5+16.6*lg[K ]+0.41(%[G+C])-(675/n) 。以上两种算法都是基于碱基组成而不是碱基排 列而计算的，事实上相同碱基组成的引物Tm 可能差异不小：GGGAA 和GAGAG 的Tm 是 不一样的，所以确定引物Tm 最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻 碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序如Primer5 等均使用近邻分析法。 第 1 页 共 11 页 中国生命科学论坛精华帖之—— PCR 专 题 （1） 9.当在引物 5’端添加酶切位点时要考虑：a)该目的序列内部不得含有相同的酶切位 点，在引物发出后才发现错误的事情本人就干过，在论坛上也能看到这样的粗心人。这样的 错误会给将来的克隆造成麻烦。b)如果打算PCR后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再 加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的，关于这一点，论坛里讨论过好几次 了，到 /List.asp?BoardID=95，用“保护碱基”为关键词搜索一下 吧。如果不设计保护碱基，则多半要用TA克隆的方式连接到质粒上，这时要注意Taq酶的 选择，