夹心ELISA 实验方案 - Abcam.PDF

夹心 ELISA 实验方案 夹心夹心 ELISA的一般程序和提示的一般程序和提示 （包括如何找到成对匹配抗体的详细信息（包括如何找到成对匹配抗体的详细信息 ）） 夹夹心心 的一般程序和提示的一般程序和提示 （（包括如何找到成对匹配抗体的详细信息包括如何找到成对匹配抗体的详细信息）） 夹心 ELISA 测定两层抗体 （即捕获抗体和检测抗体）间的抗原数。要测定的抗原必须包含 少两个能够结合到抗体的抗原位点，因为至少两个抗体在夹心中起作用。 单克隆或多克隆抗体均可在夹心 ELISA 系统中用作捕获抗体和检测抗体。单克隆抗体识别单 一表位，可对抗原中微小差别进行精细检测和定量。多克隆抗体通常用作捕获抗体以沉降尽 可能多的抗原。 夹心 ELISA 的优点是不必在分析前纯化样品，并且测定非常灵敏 （灵敏度比直接或间接 ELISA 高 2 至5 倍）。 一般附注一般附注：： 一般附注一般附注：： 夹心 ELISA 程序可能难以优化，应使用已测试的成对匹配抗体。这样可确保抗体检测靶蛋白 上的不同表位上的不同表位，，因而不会干扰其它抗体结合因而不会干扰其它抗体结合。。因此因此，，我们不能保证我们的抗体可用于夹心我们不能保证我们的抗体可用于夹心 ELISA，除非它们已专门针对夹心 ELISA 进行过测试。请查看抗体数据表获取已测试应用的 信息。 一般程序一般程序：： 一般程序一般程序：： 用捕获抗体包被用捕获抗体包被 用捕获抗体包被用捕获抗体包被 1. 用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液 (pH9.6) 中浓度为 1-10 μg/ml 的捕获抗体包被 PVC 微量滴定 板的孔。 如果使用未纯化抗体 （例如腹水液或抗血清），可能需要通过增加样品蛋白质 的浓度 （尝试用10 μg/ml ）补偿较低量的特异性抗体。 2. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在 4℃ 下孵育过夜。 3. 弃去包被液，并洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入 200 μl PBS。在水槽上方轻轻 甩动微量滴定板，除去溶液或洗涤液。在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴。 夹心 ELISA 实验方案 封闭和加封闭和加样样 封闭和加封闭和加样样 4. 每孔添加 200μl 封闭缓冲液 （5% 脱脂奶粉/PBS），封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位 点。 5. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育至少 1-2 小时，或如更方便的话，则在 4℃ 下孵育过夜。 6. 将 100 μl 适当稀释的样品添加到每个孔。要得到准确的定量结果，通常做法是比较未 知样品与标准曲线的信号。每个酶标板都必须测定标准品 （两重测定或三重测定）和空白 样，以确保准确性。在 37℃ 下孵育 90 分钟。 为了进行定量，所用标准品浓度应涵盖抗体结合的大部分动态检测范围。可能 需要优化浓度范围 以确保获得合适的标准曲线。为了进行精确定量，通常样品 和标准品采取两重测定或三重测定。 7.7. 弃弃去样品去样品，，并洗涤微量滴定板两次并洗涤微量滴定板两次，，每次在微孔中加入每次在微孔中加入 200 200 μlμl PBSPBS。。 用检测抗体孵育，然后用二抗孵育。 8. 将 100 μl 稀释的检测抗体添加到每个孔。 确保检测抗体识别与包被的捕获抗体有所差别的靶蛋白表位。这可以防止对抗 体结合的干扰，并且确保检测抗体的表位可用于结合。尽可能使用已测试的成 对匹配抗体。 9. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 2 小时。 10.用 PBS 洗涤微量滴定板四次。 11.添加 100 μl 偶联二抗，其在使用前便已在封闭缓冲液中稀释成最佳浓度 （依照制造商 说明书 ）。 12.用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 1-2 小时。 13.用 PBS 洗涤微量滴定板四次。 夹心 ELISA 实验方案 检测检测 检测检测 虽然有许多不同类型的酶可用作检测，但是辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (ALP) 是 ELISA 测定中最广泛使用的两种酶。某些生物材料具有高水平内源酶活性 （例如肺泡细胞 中 的高水平 ALP、红细胞 中的高水平过氧化物酶），考虑到这一事实是非常重要的，这可能会 导致非特异性信号。如有必要，用左旋咪唑