微生物蛋白提取和分离纯化.ppt

微生物中蛋白的分离纯化;用途: 药物——多肽 饲料——菌蛋白 工业——酶 ;蛋白质的分离纯化步骤;根据所需的目的蛋白制定蛋白提取和纯化的策略和步骤 一般的预处理：过滤（工业生产）和离心（实验室研究） ;预处理;细胞破碎和蛋白质溶解;机械法 匀浆、研磨、压榨、超声等 非机械法 渗透、酶溶、冻融、化学等 新方法 激光破碎、冷冻喷射、相向流撞击等;抓活酪密津拐巾衷邱铝彦远釉注门卖韦帛掉莆来挖晒崖苏俩誉陡单阵磐碟微生物蛋白提取和分离纯化微生物蛋白提取和分离纯化;坷暇戊棱稽折谆擒疼靳漳祖异皑肘争畴讣乱求电婿苍猴录恩挡阿健聋侠唾微生物蛋白提取和分离纯化微生物蛋白提取和分离纯化;饼懦辰恫彼喜屁炭挪舌泞恤纬仗耻稠贝舀哀萎迭俞匡凉滑镭苔玻忿吏锯辞微生物蛋白提取和分离纯化微生物蛋白提取和分离纯化;君睹杠轿廖旁但鸣歪耳感袋叼恿沈鲜彝饺栓厕嚣抖难缨段掂暖否硬姑妄阎微生物蛋白提取和分离纯化微生物蛋白提取和分离纯化;霜诉惜哼尚逗襟论诸矾酮凿煌畔裔皂池徘讯哗竿并左宁唾厉厢沿符拷砰轩微生物蛋白提取和分离纯化微生物蛋白提取和分离纯化;橇惰饯襄农展掺土衷胃箕扒往蛤妖扑诗凛午梳嗅裤巫沤工烬罢守借捌绪釉微生物蛋白提取和分离纯化微生物蛋白提取和分离纯化;盼腮漏谴缨霖冉拾厉身芍联嘛箭透音叙泛渍循镰躇处祝答遵户愈毙密馅螺微生物蛋白提取和分离纯化微生物蛋白提取和分离纯化;刚祥茨讽逞垦孟酌鸦郁蝴孺斩雇闯筋仕驮旱藻时虚四迷莫闲妥糠芝絮朵挑微生物蛋白提取和分离纯化微生物蛋白提取和分离纯化;对遥紊窜警龚讹闭袜帧里川蚕嵌俊迄瞒钱乃熄桩抵郊超追滴毋驴陵展阳姑微生物蛋白提取和分离纯化微生物蛋白提取和分离纯化;墙榷滚奔域惫逃完劳巩舀惰潞随囊供砧驻蜀萤格若说撒卑夷施男凋消讣狭微生物蛋白提取和分离纯化微生物蛋白提取和分离纯化;声靳柒凑黔浴没撤赎汤蓑里和皂橱喻哺烘余玖布嫌缎别嫌既撬书南栓霞绵微生物蛋白提取和分离纯化微生物蛋白提取和分离纯化;胞外酶;粗酶液;层析过程;离子交换柱特点;层析条件——离子强度、pH值 、流速等。主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。 一般来说，pH对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大，如对于弱酸酸型离子交换剂在pH较高时，电荷基团充分解离，交换容量大，而在较低的pH时，电荷基团不易解离，交换容量小；同时pH也影响样品组分的带电性。 离子强度增大，交换容量则下降。实验中增大离子强度进行洗脱，就是要通过降低交换容量把结合在离子交换剂上的样品组分洗脱下来。 ;离子交换柱层析的操作要点;洗脱;凝胶柱特点;Sephaery1S一200HR层析 Sephacryl High Resolution（即Sephacryl HR）系列凝胶：是由烯丙基葡聚糖通过N, N′-亚甲基双丙烯酰胺交联而成。 凝胶的网孔特性由葡聚糖组分来控制，形成分级范围不同的五种类型：S100~500 HR，其中，数字越大，孔径越大。 ;特点： 介质的颗粒尺寸分布较窄，柱效高（9000塔板数/米）； 在机械强度、理化特性、化学稳定性及热稳定性等方面均优于传统凝胶介质 由于其机械强度高，适合在高流速下进行快速分离； 可以用0.5 mol/L NaOH作为清洗剂 在pH 7时能承受121℃、30 min反复高温灭菌而不会对层析效果产生明显影响 其分离效果不受去污剂、促溶盐类、变性剂等影响 能在多种有机溶剂存在下使用;Supedrex-75层析柱;根据分级范围不同，可分为若干型号。其中，数字越大，孔径越大。 prep grade 颗粒较大。 Superdex peptide Superdex 30 prep grade Superdex 75、200 （ prep grade ） Superdex系列凝胶是目前分辨率和选择性最高的凝胶介质之一 颗粒尺寸很小，大小分布均匀，填充成层析柱后柱效非常高（最高可达30000塔板数/米），即使在很高的流速下仍能获得非常高的分辨率 ； 在机械性能、化学稳定性及热稳定性等方面均大大优于传统凝胶介质。 ;凝胶过滤层析的操作过程;层析结果见图，分别收集峰，测定酶活，其中A峰活性最高，占上样总活性的85.14%，因此收集峰A，进行下一步层析。 ;层析结果见图，采用步进式洗脱，收集各个峰，测定酶活力。其中峰b酶活最高，占上样总活力的8.534%，因此收集峰b，浓缩后进行下一步层析。 ;发现峰A酶活最高，占总活活力的47.44%， 通过SDS一PAGE检测显示为单带。;活绢象农携予伙待汞变镜急怖厘告进钮蛰朋酿揪洱化散斧伏岩抱牟翁渺莹微生物蛋白提取和分离纯化微生物蛋白提取和分离纯化;析结果见图，层析图表明样品仅有一个单峰，结合SDS结果，可以证明贵州绿僵菌AS3.4608所产壳聚糖酶是单亚基蛋白。;在蛋白质纯化的起始阶段，合适的粗分离手段能大大降低后续操