实验七 重组DNA的转化概要1.pptxVIP

实验六、重组DNA的转化; 学习将体外重组DNA引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中筛选出重组子的常用方法。;四、仪器设备;六、试剂;（1）菌种的活化：将保存于-70℃冰箱的DH5?菌种在不含抗生素的SOB平板上划线培养出单菌落（37℃，18-28小时）。 （2）种子液培养：挑取单菌落接种于15ml液体SOB培养基中，低温（20℃）震荡（200 rpm）培养6-8h（OD6000.6）。 （3）细菌的扩大培养：按照1/100的体积比将种子液接种到装有50ml液体SOB的250 ml的三角锥瓶中，于37℃振荡（250 rpm）培养约2.5小时至OD600=0.3，然后于冰水混合物中迅速摇动冷却后放冰上备用。 （4）在超净工作台上，将菌液分装入2ml的离心管中，每管1.5 ml菌液。 （5）4℃，5000 rpm离心2分钟收集菌体；弃上清液，倒置在纸巾上1分钟。 （6）加300 ul（菌液体积的1/5-4/5）预冷的0.1 mol/L CaCl2 ，手指轻弹管壁悬浮菌体，之后冰浴25 min。 （7） 4℃，5000 rpm离心2分钟收集菌体；用移液器吸取上清弃去，保留菌体。 （8）加入50 ul预冷的0.1 mol/L CaCl2，小心悬浮即为感受态细胞，4℃冰箱短暂保存 。 ;在上述制备好的感受态细胞中按下表加入各成分后用吸管头温和混匀；然后冰浴30min；于42℃恒温金属浴上温育90s；冰浴2-3min；加入100ul预热的LB培养基于37℃摇动（200rpm）45分钟；期间按照每块Amp平板加入50ul液体LB、40ul X-gal和7ul IPTG涂板，并于37℃温育至表面液体完全吸收；取150ul培养物涂板，然后将培养皿置于室温至液体被吸收；倒置培养皿，37℃培养过夜；观察转化结果。;注意事项;1、细菌液体培养一般经历四个时期，即延缓期（又称调整期）、对数期、稳定期和衰亡期。制备感受态细胞应使用处于对数生长期或者对数生长前期的细菌。通常细菌在接种3-8小时内，菌体的活性、形态和代谢等各项生理指标均处于最好的时期，此时细菌培养物的OD600≈0.2-0.4。 2、为达到高效转化，活细胞数目应该少于108细胞/ml，对于大多数大肠杆菌来说，这相当于OD600值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20分钟测定OD600值，当OD600达到0.35时，收获细菌培养物。 ;3、微量的洗涤剂或其他化学物质会大幅度降低细胞转化效率，因此最好建立一批只用于制备感受态细胞而不用于其他目的的玻璃容器，这些玻璃器皿应用手来刷洗，并且用纯水充满，再经高温高压消毒。 4、制备感受态细胞的菌种不应该使用在实验室中连续传代或存放于4℃或室温的培养物，而应该使用冻存于-70℃的储备菌直接培养。 5、制备感受态细胞过程中，不应该用枪头吸打的方式悬浮细胞。 6、实验表明，细胞于4℃在CaCl2溶液中保存24-48h，在贮存的12-24h内，转化效率增加4-6倍，然后降低到初始水平。 7、若长期保存，则加入等体积30%甘油于-70℃保存备用。 8、对大多数克隆方面的用途来说，50ul感受态细胞悬液已足够了。一般25ng DNA/50ul感受态细胞，其中DNA体积不应超过感受态的5%。 9、当用连接产物做转化时，它比超螺旋质粒DNA的转化效率至少低2个数量级，因此质粒转化时，用于涂板的培养物要少，或者进行梯度涂板。 10、用CaCl2制备和转化感受态大肠杆菌转化效率一般为5×106-2×107个转化克隆/ug超螺旋质粒。 ;X-gal溶液（2%，m/V） （5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷，20 mg/mL） 配制方法：用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20 mg/mL的储存液。使用玻璃管或者聚丙烯管保存储存液。装有X-gal溶液的试管需用铝箔包裹以防因光照而破坏，并应??存于-20℃。 X-gal溶液无需过滤除菌。 ;?-半乳糖苷酶（LacZ）和?-互补;;（乳糖）; IPTG与别乳糖结构相似，但不能被降解。也能与阻遏蛋白结合起去阻遏作用，常作为lac操纵子的诱导剂而使用。;卫星菌落;思考题