内质网应激因子PERK在抑郁模型大鼠海马组织中表达及β―细辛醚干预作用.doc

内质网应激因子PERK在抑郁模型大鼠海马组织中表达及β―细辛醚干预作用 　　【摘要】 目的：探?内质网应激因子PERK在抑郁模型大鼠海马组织中的表达及β-细辛醚的干预作用。方法：将100只SD大鼠随机分为5组（正常对照组、模型组、氟西汀组、β-细辛醚低剂量组和高剂量组），每组20只。孤养结合慢性不可预见性刺激，模型复制成功后第2天给予氟西汀组和β-细辛醚组1次/d灌胃，给药剂量分别为氟西汀10 mg/（kgd）、β-细辛醚25 mg/（kgd）、β-细辛醚50 mg/（kgd）。于实验前和实验第29天，对大鼠进行行为学测量，采用免疫组织化学检测法检测PERK蛋白水平。结果：经28 d慢性不可预见性温和刺激（CUMS）后，模型组大鼠水平运动和垂直运动得分均明显低于正常对照组（P 　　doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.15.002 抑郁症的发病率呈现逐年增加的趋势，其病因较为复杂，病程较长，严重影响个人及家庭的生活质量[1]。近年来研究发现，内质网应激在神经系统疾病发生、发展中的作用也开始逐渐被关注，关于内质网应激可以引起神经元的凋亡已经在许多神经退行性疾病的发病机制研究中得到证实[2]，另有数据证实内质网应激亦是自噬的诱导因素[3-4]，自噬平衡内质网应激诱导的内质网膨胀，维持细胞存活，也可以调节大鼠抑郁症状。本实验主要从内质网应激角度，探讨内质网应激因子PERK在抑郁模型大鼠海?R组织中的表达 1 材料与方法 1.1 动物及药品 （1）动物：清洁级SD大鼠，2～3月龄，体重180～200 g，哈尔滨医科大学实验动物医学部，许可证号SCXK（黑）2013-0001。（2）药品及试剂：β-细辛醚标准品（天津一方科技有限公司，批T9K），盐酸氟西汀胶囊（苏州俞氏药业有限公司，批号100201），蛋白激酶R样内质网激酶PERK抗体（美国Cell Signaling公司，批号为#9451），山羊抗兔IgG、兔抗山羊IgG（北京康为世纪生物科技有限公司，批号分别为CW0103、CW0105） 1.2 仪器 CX31R BSF型光学显微镜（Olympus），DP801型图像分析系统（Alphamiager公司），DK-8D型电热恒温水浴箱（上海合恒仪器设备有限公司），THZ-82型恒温振荡器（江苏太仓医疗器械厂），AL204型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），METTLER TOLEDO 型PH测试仪（上海秋腾贸易有限公司），79-1型磁力加热搅拌器（上海雷磁新泾仪器有限公司）等 1.3 方法 1.3.1 造模及给药 大鼠适应性喂养1周后，随机分为5组，每组20只大鼠。正常对照组不给予任何刺激和药物；模型组给予生理盐水灌胃；氟西汀组给予盐酸氟西汀10 mg/（kgd）；β-细辛醚低剂量组给予β-细辛醚25 mg/（kgd）灌胃；β-细辛醚高剂量组给予β-细辛醚50 mg/（kgd）灌胃。对照组大鼠每5只一笼饲养，自由饮食饮水。其他各组大鼠单笼孤养，采用慢性不可预见性刺激处理[5]，持续28 d，每种应激方式使用不超过3次，避免大鼠耐受。具体应急方式为：禁食水24 h、热刺激5 min（45 ℃）、夹尾3 min、强迫冰水游泳10 min（4 ℃）、鼠笼倾斜24 h（45°）、束缚24 h、潮湿环境24 h、声音刺激12 h（120 dB）、昼夜颠倒、摇晃1 h、闪光灯照射12 h、通宵拥挤。除对照组外其余各组大鼠从造模开始后第8天开始给予生理盐水或相应药物，1次/d，共28 d 1.3.2 行为学评价 在实验前和实验第29天进行旷场实验（Open-field-test）观察各组大鼠行为学变化。实验用敞箱为无盖方箱，高40 cm，长宽均为125 cm，箱内四壁涂成黑色，底板白色，底板用黑线划成25个25 cm×25 cm的等边方格。实验进行时环境安静，敞箱周围参照物不变。将单只大鼠轻放于敞箱底板正中心的方格内，记录大鼠3 min内动作行为表现包括水平穿越格数、直立次数。以大鼠的四肢完全进入一个方格区域作为水平运动的1分，以双前肢完全抬离地面作为直立次数的1分。每只大鼠单独测试，每检测完一只大鼠后用75%乙醇彻底清洁敞箱并干燥后再进行下一只大鼠的检测 1.3.3 免疫组织化学法检测大鼠海马组织PERK蛋白表达 取石蜡包埋的大鼠海马组织，于相应部位进行连续切片各5张，脱蜡和水化后进行抗原修复。采用过氧化物酶标记的链霉卵白素（SP）法进行免疫组织化学染色，并DAB显色，经过苏木素复染、PBS洗涤、盐酸乙醇分化后返蓝，常规脱水、透明、中性树胶封片。每一张切片在阳性表达区域挑选10个无重叠视野，使用Olympus显微镜、DP801形态分析软件进行图像