牛腹泻病毒检测(PCR法)及其影响因素分析.docVIP

牛腹泻病毒检测(PCR法)及其影响因素分析 　　摘要：PCR技术是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，该技术通过重复高温变性、低温退火、中温延伸等简单的3个温度循环，能将靶DNA扩增数百万倍，获得极高的检测敏感性。通过PCR技术对新生牛是否带有牛病毒性腹泻病毒的血清样本进行检验，并对影响其检测效果的因素进行了分析 关键词：牛腹泻病毒（BVDV）；PCR；引物 中图分类号：S858.23 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2017）04-0005-02 牛病毒性腹泻（黏膜病）是由牛病毒性腹泻病毒[1]（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的传染病，各种年龄的牛均易感染、以幼龄牛易感性最高 牛病毒性腹泻（黏膜病）的病原体属于披膜病毒科瘟病毒属的成员。病毒粒子呈圆形，有囊膜，直径50～80 nm。RNA核芯直径（24±4）nm，分子量3×106，沉降系数80～90 s 牛病毒性腹泻（黏膜病）可以穿过胎盘感染，特别是怀孕早期。其病毒血清抗体阴性的母牛一旦感染，常常通过胎盘使胎儿产生免疫抑制，引起持续性病毒血症，如果小牛正常产出，病毒血症能持续地带入成年期，这种牛临床貌似健康，血清中又无保护性抗体，但体内始终带毒，是牛群中最危险的传染源[2] 本研究是通过PCR技术检验新生牛是否带有牛病毒性腹泻病毒，排除患病牛，制备无病毒血清，进一步用于兽药的研制，并对影响其检测效果的因素进行了分析 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂 RNAiso plus，购自Takara公司；氯仿、无水乙醇、75%乙醇，DEPC水、ddH2O、DNA Marker?自TakaRa公司；核酸染料购自百泰克有限公司 1.1.2 器材、仪器准备 1 000 μL枪，200 μL枪，50 μL枪，1 000 μL枪头，200 μL枪头，75%酒精棉，止血钳，EP管，EP管架；PCR扩增仪（美国伯乐公司，型号为S1000）等 1.1.3 样品 共24个样本，包括22个未知样本（均为新生牛初血清），阴性对照和阳性对照 1.2 方法 PCR技术，即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是由Saiki发明，因其技术对世界生物医学的巨大推动作用，获得了1992年的诺贝尔医学奖[3]。由美国PE-Cetus公司的Kary Banks Mulis在1985年建立的[4]。这项技术可在试管内经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展 1.2.1 提取步骤 （1）取2 mL无菌无酶EP管，加入RNA Siso Plus（裂解液）900 μL（加液过程中如枪头接触到EP管壁或其他物品，需更换枪头），再分别吸取待测血清样品、阳性对照、阴性对照各200 μL于EP管中，每加一次样品换一次枪头。轻轻上下颠倒摇匀至底部无沉淀，颜色均一，冰盒中静置5 min。将已检测样品放-20 ℃冷冻保存（阴性对照放在中间顺序） （2）12 000 r/min、4 ℃离心1 min。加入200 μL的氯仿，上下颠倒20次混匀，至颜色均一为乳粉色，冰盒中静置8 min （3）12 000 r/min、4 ℃离心15 min。在离心剩余2 min时准备新1.5 mL无菌无酶EP管，加入800 mL -20 ℃预冷的异丙醇。从离心机轻拿轻放取出EP管（离心后液体分为三层，底层为有机溶液层，中层蛋白质，上层上清液含RNA）。吸取400 μL上清液（分两次，每次200 μL吸取，吸取上层液体时切勿碰触或吸取中层蛋白质），放入事先加好异丙醇的新1.5 mLEP管中，轻轻上下颠倒20次摇匀，-20 ℃静置20 min[5] （4）12 000 r/min、4 ℃离心15 min。离心机中EP管摆放方向保持一致，以使沉淀在管底同一侧。若离心后不出沉淀继续-20 ℃放置10～20 min后离心。弃上清，保留沉淀。沉淀即为RNA提取物，量很少，在倒上清液时注意切勿将沉淀倒出 （5）加入1 mL75%乙醇（DEPC水配制，加乙醇过程中如枪头接触到EP管壁或其他物品，需更换枪头），轻轻上下颠倒，洗涤沉淀，将沉淀悬浮起来即可 （6）7 500 r/min、4 ℃离心5 min。弃上清，保留沉淀。用200 μL枪头将管底残余乙醇液体吸净，吸取一个样品换一个枪头，注意不要碰触和吸取到RNA沉淀 （7）EP管中的RNA在超净工作台中室温下自然干燥10 min。加入20 μL的无RNase水（将水加到沉淀上），轻弹溶解沉淀，短期使用-20 ℃