第2章：微生物分子生态学.PPT

荧光物质 Propidium Iodide (PI)（红色） DAPI（蓝色） quinacrine（绿色） chromomycine A3（绿色） 酶联荧光原位杂交CARD-FISH CARD-FISH（ catalyzed reporter deposition fluorescent in situ hybridization ），是荧光原位杂交(FISH)的一种变形，可以更有效地增加信号强度，避免背景干扰。 FISH的优点 操作简便，探针标记后稳定，一次标记后可使用二年； 方法敏感，能迅速得到结果； 在同一标本上，可同时用几种不同探针，使用几种颜色的荧光； 不仅可用于分裂细胞染色体数量或结构变化的研究，而且还可用于静止期细胞的染色体数量及基因改变的研究。 FISH在环境微生物生态学应用中的优点 FISH是利用带有荧光标记的探针与固定在玻片或纤维膜上的组织或细胞中特定的核苷酸序列进行杂交，无需单独分离出DNA或RNA； 探测其中所具有的同源核酸序列，结果可以直接在荧光显微镜下观察，探测的灵敏度可达到10～20个mRNA拷贝/cell； 根据探针序列的不同，特异性探针与相应的靶核糖体结合，能鉴定到科、属、种。 2）基因克隆文库与RFLP分析 5’ 5’ A A PCR扩增产物 T T 5’ 5’ T 载体 T7 lacZ MCS ori Apr 铺板 铺板 目的重组克隆 T T 5’ 5’ T 载体 T7 lacZ MCS ori Apr 基因克隆文库的筛选 直接送测序 限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP） 限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP） RFLP是发展最早的DNA技术，RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。 /olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::525::530::/sites/dl/free/0072464631/291136/rflp.swf 利用限制内切酶消化基因组DNA时，会产生大小不同的DNA片段，经过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，从而揭示出DNA的多态性。 3）变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术 DGGE 通过在凝胶中建立由低到高的变性剂浓度，使变性条件不同的DNA片段依次变性，产生电泳迁移速率的差异，从而将其分离开来。 1993年Muyzer等首次将DGGE引入微生物生态学研究，用以描述环境微生物种群的多样性、数量比例以及动态变化等方面。它的分辨精度比琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳高得多，可以检测到一个核苷酸水平的差异。 DGGE原理 DGGE步骤 DGGE优点 快速； 简便； 灵敏； 安全。 DGGE缺点 太灵敏； 重复性差。 细菌质粒：细菌细胞中染色体以外的共价闭合环状DNA分子 (cccDNA)，其大小在1-1700 kb之间。根据质粒控制的性状，可以把细菌质粒分成抗性质粒、降解质粒、毒力质粒和共生质粒等类型。 细菌质粒控制的性状--抗性 a. 抗生素抗性 细菌质粒控制的性状--抗性 a. 抗生素抗性 b. 重金属抗性 c. 阳离子抗性 d. 其它抗性 细菌质粒控制的性状—结合转移 a. 致育性：F因子 最早在大肠杆菌中发现，以后在其他菌中也观察到，主要见于革兰氏阴性菌。在电镜下可观察到细菌间借伸长的性菌毛进行接合。细菌能否在接合中作为基因传递供体取决于致育因子（Fertility factor）又称F因子。这是最早发现的一种质粒。F因子编码在细菌表面产生性菌毛。F因子的特性为可以促进供体菌向受体菌传递染色体DNA或质粒。 细菌质粒控制的性状—代谢能力 a. 转基因 Ti（tumor-inducing）质粒。Ti是在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子。它控制根瘤的形成，可作为基因工程的载体 细菌质粒控制的性状—代谢能力 b. 抗生素和细菌素的产生 c. 固氮：含Nit质粒的根瘤菌 d. 糖、蛋白质、柠檬酸等代谢 e. 色素合成 f. 等。 真核生物的DNA质粒： 环状DNA质粒：酵母2mm质粒，植物线立体中的环状DNA质粒，人和动物的核DNA质粒等，它们都是不知其功能的隐蔽质粒。 线状DNA质粒：乳酸克鲁维酵母的嗜杀线状DNA质粒，植物线粒体中与雄性不育有关的线状DNA质粒。 有壳体的dsRNA质粒：由蛋白质壳体包裹，存在于某些真菌和植物细胞中