PAGE测定蛋白质的相对分子量.ppt

SDS - PAGE测定蛋白质的相对分子量 一、实验目的 了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量。 二、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。 SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。 三、实验器材 直流稳压电泳仪 垂直平板电泳槽（含玻璃板、夹条、梳齿、夹子等） 移液器（1.0ml、200μl、20μl） 微量注射器（20μl） 烧杯、培养皿、试管、滴管、直尺 脱色摇床 四、实验试剂 1. 凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g和亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g重蒸水溶 解后，定容至100ml，棕色试剂瓶4℃保存，30天内使用。 2. 分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。 18.15 Tris（三羟甲基氨基甲烷），少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH8.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。 3. 浓缩胶缓冲液：0.5mol/LHCl，pH6.8。 6gTris, 少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH6.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。 4. 10%SDS，室温保存。 5. 两类样品缓冲液： 2倍还原缓冲液（2×reducing buffer） 0.5mol/L HCl，pH6.8 2.5 ml 甘油 2.0 ml 质量浓度10%SDS 4.0ml 质量浓度0.1%溴酚蓝 0.5ml β-巯基乙醇 1.0 ml 总体积10 ml 四、实验试剂 6. 电极缓冲液，pH8.3。 Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml，4℃保存。 7. 低分子量标准蛋白质（上海产）。 开封后溶于200μl重蒸水，加200μl 2倍样品缓冲液（还原缓冲液），分装20小管，-20℃保存。临用前沸水浴3～5min，其相对分子量（Mr）如下： 兔磷酸化酶B 97 400 牛血清白蛋白 66 200 兔肌动蛋白 43 000 牛碳酸酐酶 31 000 胰蛋白酶抑制剂 20 100 鸡蛋清溶菌酶 14 400 8. 质量浓度为10%过硫酸铵： （临用前配制） 9. 染色液： 0.25g考马斯亮蓝R250，加入40ml甲醇，10ml冰醋酸,蒸馏水定容至100ml，过滤。 10. 脱色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸与875 ml重蒸水混合。 11. 待测蛋白样品。 12. 1%琼脂糖（最好用电极液配） 13. TEMED 五、实验步骤 1、洗净晾干电泳槽、玻璃板、夹条、梳齿等。安装后用1%琼脂糖封玻璃板两侧及底部。 2、分离胶的选择和配置方法 1）按照待分离蛋白质的大致分子量选用不同浓度的胶。 2）分离胶和浓缩胶的配制方法 五、实验步骤 3、分离胶的灌制 按照上表左边操作。因加入TEMED后凝胶就开始聚合，故应立即混匀混合液，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，避免气泡。留出梳齿的齿高加1cm空间以便灌注浓缩胶。用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约40～60min，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的重蒸水。 4、浓缩胶的灌制 （等分离胶聚合后配制）