ELISA定量检验方式构建.docVIP

ELISA定量检验方式构建 作者：赵玉秀 马可 梁宏阳 苏桂民 赵硕 李爱灵 张月兰 王辉 单位：北京天坛生物制品股份有限公司 以200901批酿酒酵母蛋白为抗原，将其与等体积的弗氏完全佐剂混合，乳化，经背部皮下多点注射免疫青紫蓝家兔；2周后，用等体积的抗原与弗氏不完全佐剂混合，乳化，经相同部位注射进行加强免疫，共加强3次。末次免疫1周后，心脏采血，分离血清。 抗酿酒酵母蛋白IgG抗体的纯化采用辛酸-硫酸铵沉淀法［6］纯化抗酿酒酵母蛋白IgG抗体，SDS分析抗体纯度；免疫双向扩散法测定抗体效价；Westernblot法分析抗体的特异性（分别取4、8和16mu;g的酿酒酵母蛋白上样，以兔抗酿酒酵母蛋白抗体为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗）。 酶标抗体的制备采用Lowry法测定抗酿酒酵母蛋白IgG抗体的蛋白浓度，改良过碘酸钠法［7］进行HRP标记。 双抗体夹心ELISA法的建立参考文献［8］。采用棋盘滴定法确定包被抗体和酶标抗体的工作浓度，对样品孵育时间和酶标抗体反应时间等进行优化，确定最佳反应条件。 抗原参考品标准曲线最佳线性范围和最低检测限的确定：将抗原参考品稀释至400、200、100、50、25、12.5和6.25ng／ml，绘制标准曲线，经直线回归方程计算，确定最佳线性范围，并确定该法的最低检测限。 特异性验证：用建立的双抗体夹心ELISA法分别检测小牛血清、人血白蛋白、MEM培养基、Vero细胞上清蛋白、乙型脑炎纯化疫苗、冻干人用狂犬病疫苗样品，验证该方法的特异性。 准确度和精密度验证：用建立的双抗体夹心ELISA法检测不同浓度的酿酒酵母蛋白抗原参考品（200、100、50、25、12.5、6.25ng／ml），重复10次，计算回收率和变异系数（CV），验证方法的准确度和精密度。 适用性验证：用建立的双抗体夹心ELISA法测定200906231、200906232和200906233批酿酒酵母重组乙型肝炎疫苗生产各工序样品（由本公司乙肝疫苗室提供）中酿酒酵母HCP，验证该法的适用性。酿酒酵母蛋白抗原参考品的含量经Lowry法测定3批酿酒酵母抗原蛋白的平均含量分别为1.61、1.64和1.63mg／ml。 抗酿酒酵母IgG抗体的鉴定纯化的抗体经SDS分析，纯度为91.7％；经免疫双向扩散法测定抗体效价为1∶64；Westernblot分析表明，纯化的抗体能与酿酒酵母蛋白多数条带结合，具有良好的特异性，见图1。 双抗体夹心ELISA法反应条件的优化经棋盘滴定法确定抗酿酒酵母IgG抗体的包被浓度为20mu;g／ml，酶标抗体的工作浓度为1∶2000，样品孵育时间和酶标抗体反应时间分别为60和40min。 抗原参考品的最佳线性范围和最低检测限：酿酒酵母抗原参考品的标准曲线见图2，最佳线性范围为6.25～200ng／ml，最低检测限为6.25ng／ml。2.4.2特异性：用建立的双抗体夹心ELISA方法检测小牛血清、人血白蛋白、MEM培养基、Vero细胞上清蛋白、Vero细胞乙型脑炎疫苗及PHK细胞狂犬疫苗，均无特异性反应，表明该方法特异性良好。 准确度和精密度：检测不同浓度的抗原参考品回收率在97.6％～107.00％之间，变异系数均＜10％；检测6.25和12.5ng／ml的抗原参考品回收率低，变异系数大，不能作为定量测定。见表1。因此最低定量检测限为25ng／ml，低于25ng／ml只能做定性检测。 适用性：检测结果表明，3批乙型肝炎疫苗各生产工序中的酿酒酵母HCP均呈下降趋势，表明该方法可有效地反映出各工序中酿酒酵母HCP含量，见表2。 目前，以酿酒酵母为宿主的生物制品有重组乙型肝炎疫苗、注射用重组人干扰素alpha;2a、alpha;2b等。重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）采用免疫印迹法检测其纯度；注射用重组人干扰素alpha;2a、alpha;2b（酿酒酵母）则采用《中国药典》三部（2010版）方法测定菌体蛋白残留量。酶联免疫法测定酵母表达系统生产的重组制品，与免疫印迹法相比，耗时短，操作简单。本文建立的检测生物制品中酿酒酵母蛋白残留量的方法若制作成酶标试剂盒，则会填补国内的空缺。 本实验依据酿酒酵母重组疫苗的生产工艺制备了3批酿酒酵母蛋白，并制备了酿酒酵母蛋白参考品。以酿酒酵母蛋白为抗原免疫家兔，制备了兔抗酿酒酵母血清，采用辛酸-硫酸铵沉淀法，纯化获得了兔抗酿酒酵母蛋白IgG，经SDS和Westernblot分析，制备酶标抗体，建立了酿酒酵母ELISA双抗体夹心法，经验证，线性关系良好，最低检测限为6.25ng／ml，最低定量检测限度为25ng／ml，精密度及准确度良好，有望开发为酵母细胞HCP定量检测试剂盒。 1