骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体在成骨过程中与血管内皮细胞生长因子关系论文.docVIP

　　骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体在成骨过程中与血管内皮细胞生长因子关系论文 韩冬，李建军，孙鸿斌，李春雨，王悦书 【摘要】 ［目的］探讨骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体（A rebinant adenoviral vector carrying the human BMP2 gene,AdBMP2）在成骨过程中和血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial groarro cells,BMSC），感染后观察BMP2、VEGF和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）表达及钙结节形成。同时将30 μl AdBMP2行裸鼠左后肢肌组织内注射，术后20 d取材，免疫组化和原位杂交法观察BMP2与VEGF体内表达情况。30 μl β半乳糖苷酶腺病毒载体（Ad β gal）右后肢肌内注射作为对照。［结果］BMSC被AdBMP2感染后.freelin×10 min离心取上清收获病毒。氯化铯密度梯度离心法纯化，空斑形成单位测定病毒滴度（PFU）。-70 ℃保存备用。 1.2.2 兔BMSC的培养 健康日本大耳白兔，（2.0±0.5）kg，3％戊巴比妥钠（30 mg/kg，腹腔麻醉。骨髓穿刺针接10 ml注射器，内含稀释的肝素钠2 500U/ml约0.5 ml，从胫骨结节外侧穿刺，抽取骨髓液2～3 ml，2 ml PBS混匀，注入含有4 ml淋巴细胞分层液的试管内，密度梯度离心，1 500 r/min离心15 min，吸取中间单核细胞层，PBS洗2次，以2×104 /cm2的密度接种于50 ml培养瓶内，加含10%胎牛血清DMEM培养液5 ml。在5%CO2孵箱内37 ℃培养4 d，更换培养液时将未贴壁的细胞全部弃掉,继续培养且每周换液2次。12～14 d后基本长满单层,用0.25%胰酶消化，以1×104 /cm2的密度传代培养。 1.2.3 AdBMP2感染BMSC BMSC按1×104/孔的密度接种于24孔培养板，待细胞长至近60%融合时，更换为2%胎牛血清DMEM培养液，根据计数的细胞数加入AdBMP2（MOI为100），过夜，次日晨更换5%胎牛血清DMEM培养液继续培养。Ad β gal同等条件下感染检测感染效率。 1.2.4 AdBMP2裸鼠体内注射 使用2％戊巴比妥钠0.1 ml/只麻醉。双后肢消毒后，微量注射器抽取30 μl AdBMP2（6×108病毒颗粒）于4只裸鼠左后肢近膝关节肌组织内处注射，再抽取30 μl Ad β gal（6×108病毒颗粒）于裸鼠右后肢近膝关节处注射，作为对照。 1.2.5 感染后BMSC成骨分化 细胞感染后3 d，采用RTPCR方法观察hBMP2的mRNA表达，7 d后采用ALP染色试剂盒观察ALP的表达。感染后21 d，茜素红染色显示钙结节，未感染细胞和Ad β gal感染组细胞作为对照。 1.2.6 检测感染后细胞VEGF的表达 细胞爬片、感染后7 d，固定，采用免疫组织化学染色方法观察VEGF的表达情况，未感染细胞作为空白对照。然后利用图像分析系统计数每组细胞中VEGF的平均染色灰度值，以确定细胞中VEGF的相对含量。数据采用SPSS 11.0统计软件进行统计学处理，均数±标准差表示，t检验检测（P＜0.05有显著性差异）。 1.2.7 检测注射处组织hBMP2和VEGF表达 注射后20 d，麻药过量致死，于注射处取材，4%多聚甲醛（含0.1%DEPC）固定样本，EDTA脱钙，常规制片。原位杂交法和免疫组化法检测注射处组织hBMP2和VEGF表达。 2 结果 2.1 重组腺病毒载体滴度测定 重组腺病毒可以在覆盖到293细胞的琼脂糖平板上形成噬菌斑。通过感染293细胞扩增重组病毒及纯化后，测得AdBMP2滴度为2×1010 pfu/ml。 2.2 BMSC培养 原代BMSC接种后在培养瓶底散在分布，梭形。7 d细胞形成集落状，长梭形，此后细胞集落融合成片，呈旋涡状排列，12～14 d传代，传代后细胞呈纺锤形，散在均匀分布，不再集落样生长，3 d左右长满瓶底。 2.3 BMSC感染后向成骨细胞分化 βactin作为标准化内参，hBMP2 mRNA在AdBMP2感染后3 d开始表达，而对照细胞则为阴性（图1）。ALP染色显示感染后7 d细胞呈红色阳性着色（图2），而对照组细胞阴性。茜素红染色显示感染后21 d红色钙结节形成（图3），对照组则为阴性。 图1aβactin 180bp 26个循环（略） 图1bhBMP2 339 bp 30个循环；1为未经处理细胞；2为感染Ad