流感病毒实验室检测剖析.pptVIP

国家流感中心定期组织对各流感监测网络成员单位进行新技术培训，重点加强未成为省级流感参比中心的省级疾病预防控制中心监测技术的培训。省级疾病预防控制中心每年组织对本省（区、市）的专业技术人员的培训，重点加强不具备病毒分离能力网络实验室的培训。 各网络实验室可选派专业技术人员至省级疾病预防控制中心或国家流感中心进修。 根据流感监测工作要求，国家流感中心和省级疾病预防控制中心可派出专家对部分网络实验室所在疾病预防控制中心技术人员进行现场示范和指导。 * 鸡胚分离流程（2） ◆用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚 ◆将针头弃于合适的生物安全装置中 ◆用消毒过的医用胶布封口 ◆ 33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养2天 鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去 鸡胚分离流程（3） ■收获尿囊液和羊水 ■鸡胚在收获前应4℃过夜或至少放置4小时 ■标记15ml 无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致 ■用70%～75％酒精消毒鸡胚顶部 ■用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。用10ml 吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。羊水较少时也可以将3个鸡胚的羊水合并 鸡胚病毒鉴定 经HA试验阴性者，将羊水和尿囊液混合，继续盲传1代（72小时），如仍为阴性，则鸡胚病毒分离为阴性，标本可弃去 鸡胚收获 HA试验 病毒鉴定 红细胞凝集 红细胞凝集抑制试验 病毒鉴定流程 红细胞凝集试验 4个凝集单位配制“回滴” 红细胞凝集抑制试验 判定流感病毒型别 红细胞凝集试验（HA） MDCK细胞或鸡胚收获的标本分离物首先用鸡、豚鼠或人红细胞进行红细胞凝集试验（HA），确定病毒滴度 原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这两种成分。因此流感病毒能与其结合并识别，产生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝素结合后，可以抑制凝集现象出现 A H B C D E F G 100ul病毒液 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 稀释完病毒液后加入50ul红细胞悬液 50ulPBS 稀释病毒 加入配制好的红细胞悬液 充分混匀，置室温孵育30-60分钟 观察记录结果 病毒 原液 1：2 1：128 HA： 32 HA＞128 HA： 4 红细胞凝集试验（HA） HA滴度≥8，进行红细胞凝集抑制（HI）试验；HA滴度8者，继续在敏感的MDCK细胞系或鸡胚上进行传代培养，使其HA滴度≥8后，再进行HI测定 若传1～2代后，HA滴度仍8者，可应用核酸检测方法进行鉴定 红细胞凝集抑制（HI）试验 HA试验完成后，用国家流感中心每年提供的抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗B（Victoria系）和抗B（Yamagata系）4种标准参照血清，进行红细胞凝集抑制（HI）试验，确定病毒的型别和亚型，进行HI试验时，需同时进行4种标准抗原对照。 红细胞凝集抑制试验步骤 4个凝集单位的配制和检测 稀释血清 加入25ul 4个血凝单位抗原，室温孵育15-30分钟 每孔加入50ul红细胞悬液，充分摇匀。室温孵育30-60分钟 观察记录结果 4个凝集单位的配制和检测 4个凝集单位的配制 读取红细胞凝集试验的结果 计算所须的4个凝集单位的病毒用量 用50ul检测4个凝集单位时，用凝集效价除以8，所得商即为4个单位的稀释度 用红细胞凝集试验“回滴”，复核4个凝集单位 用50ul，前4孔完全凝集 。此时的抗原即为4个凝集单位 红细胞凝集抑制试验稀释血清 1 2 7 6 5 3 4 9 8 10 H1 血清 50ul H3 血清 50ul 50ul PBS B 血清 50ul 25ul PBS 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul B 血清 50ul H3 血清 50ul H1 血清 50ul 流感病毒的型别判定 标准参照血清对待鉴定病毒的抑制效价≥20才可以算为阳性 一个待鉴定病毒不能同时被两种或两种以上的标准血清抑制 待鉴定病毒与标准参照血清有交叉抑制，但与一种标准参照血清抑制效价大于其他参照血清4倍以上时，可以判定为此型别的流感病毒 红细胞凝集抑制试验-质量控制 使用的试剂可靠无误 处理后的血清有无残余非特异性凝集素 读取HA试验的结果是否正确 4个血凝单位是否准确 红细胞阴性对照 待鉴定病毒确保没有被细菌污染 稀释血清、病毒、红细胞悬液加入量准确 结果