光学显微镜的几种特殊显微镜一.暗视野显微镜.PDF

光学显微镜的几种特殊显微镜 一.暗视野显微镜 暗视野显微镜由于不将透明光射入直接观察系统，无物体时，视野暗黑，不 可能观察到任何物体，当有物体时，以物体衍射回的光与散射光等在暗的背景中 明亮可见。在暗视野观察物体，照明光大部分被折回，由于物体(标本)所在的位 置结构，厚度不同，光的散射性，折光等都有很大的变化。 暗视野显微镜在普通光学显微镜台下配一个暗视野聚光器,来自下面光源的 光线被抛物面聚光器反射，形成了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束。因 此视野是暗的，视野中直径大于 0.3m的微粒将光线散射，其大小和形态可清楚 看到。甚至可看到普通明视野显微镜中看不见的几个毫微米的微粒。因此在某些 细菌、细胞等活体检查中常常使用。 二.相位差显微镜 相差显微镜是荷兰科学家Zermike于1935年发明的，用于观察未染色标本的显 微镜。活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同， 光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化(振幅差)，这种振幅差 人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象， 把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。相差显微镜和普通显微镜的区 别是:用环状光阑代替可变光阑， 用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合 轴用的望远镜。 相差显微镜具有两个其他显微镜所不具有的 功能:①将直射的光(视野中背景光)与经物体衍 射的光分开;②将大约一半的波长从相位中除 去，使之不能发生相互作用，从而引起强度的变 化。 相差显微镜（phasecontrast microscope） 由P．Zernike于1935年发明，并因此获1953 相差显微镜 年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以 观察未经染色的标本和活细胞。 相差显微镜的基本原理是，利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差 别，把通过物体不同部分的光程差转变为振幅（光强度）的差别，经过带有环状 光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现观测的显微镜。主要用于观察活细胞 或不染色的组织切片，有时也可用于观察缺少反差的染色样品。 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比 度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路， 同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ， 两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。在构造上，相差显微镜有 不同于普通光学显微镜两个特殊之处： 1.环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，作用是使透过 聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 2.相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将 直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种： 1.A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标 本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。 2.B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形 成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。 相差显微镜使用中的几个问题： （1）相位倒转 当n’n或n’n时得到象的明暗反差正好相反，称为相位 倒转。当相位差δ=0时是无法识别的，随着δ的增大反差变大，当δ继续增 大到某一值后会出现相位倒转。用90%高吸光值（高反差）物镜时，这个转变值 约为0.55λ，用70%标准吸光值的物镜时约为0.33λ。较高吸光值的物镜应该 用于分辨较小的光程差。 （2）晕轮和渐暗效应 在相差显微镜成象过程中，某一结构由于相位的延迟 而变暗时，并不是光的损失，而是光在象平面上重新分配的结果。因此在黑暗区 域明显消失的光会在较暗物体的周围出现一个明亮的晕轮。这是相差显微镜的缺 点，它妨碍了精细结构的观察，当环状光阑很窄时晕轮现象更为严重。相差显微 镜的另一个现象是渐暗效应，指相差观察相位延迟相同的较大区域时，该区域边 缘会出现反差下降。 （3）样品厚度的影响 当进行相差观察时，样品的厚度应该为5μm或者更 薄，当采用较厚的样品时，样品的上层是很清楚的，深层则会模糊不清并且会产 生相位移干扰及光的散射干扰。 （4）盖玻片和载玻片的影响 样品一定要盖上盖上盖玻片，否则环状光阑的 亮环和相板的暗环很难重合。相差观察对载玻片和盖玻片