j第八章 目的基因的表达概要1.ppt

;第八章 克隆基因的表达;遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程——中心法则（central dogma）。 ;二、克隆基因的表达：;用原核生物作宿主;识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。;;;4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。;二、原核表达系统的注意事项!;是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。;consensus sequences;5’-TTGACA-3’;原核启动子共有序列的功能;（2）翻译的起始位点;AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）;2. 转录终止子;由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。 ;;;大肠杆菌偏爱UAA。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。;① 必须是一种强启动子;来自大肠杆菌的乳糖操纵子。;（3）色氨酸启动子trp;;;;;四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位;;2. 周质中表达;phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、β-内酰胺酶（lactamase）、 肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等;鼠源RNase、人生长激素信号肽。;由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。;;载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。;哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。;④终止子：;;必须选择一个有lacI的宿主菌。;载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。;;pIN III-comA1;表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。;lacI;（4）产物分离;pGEX; ;（5）其他融合蛋白系统P91;5’-TTGACA-3’;（2）-35区与-10区之间的距离;5’-AGGAGGU-3’;AUG左侧的三个碱基也有影响。;SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3-9个碱基。 在翻译起始区周围的序列不易形成明显的二级结构。;3. 启动子与外源基因之间的距离;转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。;选择强启动子序列，如tac 等;4. 增加mRNA的拷贝数和稳定性;cI857阻遏物有活性，抑制?PL启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。;调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。;（2）表达载体诱导复制 ;N末端：由原核基因编码一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。;①使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。 ②大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解作用。 ③T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。;（3）表达分泌蛋白 ;细菌蛋白分泌的条件：;③ 细胞内的转运机制。;九、外源蛋白质表达后的正确修饰;人胰岛素分子;抗体分子;如信号肽、内含肽（intein）等序列的切割。;（1）O-糖基化（Ser, Thr）;（2）N-糖基化（Asn）;磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、羰基化、豆冠酸化、软脂化;缺乏蛋白质的加工。 （如糖基化、氨基酸修饰等）。;酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。;① 能在E.coli中克隆和扩增。;Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells;由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断（选择标记）构成。;①转化率低（1-10转化子/微克DNA）。;由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断(选择标记和酵母DNA自主复制顺序ARS）构成。;ARS;特点：;在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒区。;由大肠杆菌质粒、2?m质粒及酵母染色体DNA选择标记构成。;2?m质粒：;特点：;YEp24;Leu- 酵母; （1）优点;②常常发生质粒丢失。 ③重组蛋白常常超糖基化;;;（1）细胞质内表达;;（2）表达分泌型蛋白;蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的内切蛋白酶识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来。;6.其它酵母表达系统;HBsAg: 乙肝表面抗原。可以作为疫苗。 Aox1：乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。 His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。 3’-aox1：整合到特定染色体的位点序列。;整合到染色体中;（2）牛溶菌酶C2在嗜甲醇酵母中的表达;二、昆虫培养细胞表达系统;病毒 粒子;（2）杆状病毒的表达特点;多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体。;（1）转移载体的构建;转移载体;（2）杆状病毒载体转化过程;;4.目前已经用杆状病毒在真核生物细胞中表达的外源蛋白;5. 杆状病毒大规模表达存在的问题;三、外源基因在