厚生科学研究费补助金（特定疾患调査研究事业）.doc

厚生科学研究費補助金（長寿科学総合研究事業） 分担研究報告書 マウス胚性幹細胞からの軟骨細胞の分化誘導と 軟骨細胞を用いた新規治療法の開発　 主任研究者 鈴木　登　（聖マリアンナ医大　免疫学?病害動物学） 高齢者における変形性関節症(OA)や関節リウマチ(RA)などの関節疾患の原因解明と予防?治療法の開発を目指して、軟骨細胞の分化誘導とその治療応用をモデル動物を用いて検討した。マウスの胚性幹(embryonic stem cell; ES)細胞をbone morphogenetic protein存在下に培養することで軟骨細胞を分化誘導することが出来た。この軟骨細胞は、約50％程度の純度であったが、残りの細胞も間葉系の細胞と考えられた。この軟骨細胞をコロイド鉄で標識した。変形性関節症のモデルマウス関節内に、分化誘導した軟骨細胞を移植することで、病変部関節面への軟骨細胞の生着が認められた。この細胞はBerlin Blue染色陽性でES細胞由来であることが示された。関節内で奇形種発生や異所性の化骨を認めることは無かった。一方、骨欠損部にこの軟骨細胞を移植すると骨形成が認められた。 この成績はES細胞から分化誘導した軟骨細胞そのものが関節疾患の治療に応用可能であることを示している。  A.研究目的 　高齢化社会を迎えた本邦においては高齢者が日常生活において不便なく、健康的に生活できるような施策が望まれている。その中で多発関節痛?関節炎をもたらす変形性関節症(OA) や関節リウマチ(RA)などの関節疾患は高齢者の日常的な活動性を低下させる。さらに進行した場合には手術や介護の必要度を大きく増加させる。 　高齢者の関節疾患においては現在用いられている治療法では治癒を期待する事ができないのみでなく、疼痛のコントロールすら難しいことが多い。即ち、高齢者の関節疾患の原因解明と予防?治療法の開発は難治性疼痛の緩和につながり、高齢者の生活の質の改善と高齢者社会の活性化に必須である。 　これまでにマウス胚性幹(embryonic stem cell; ES)細胞から分化誘導した軟骨細胞に発現される転写因子を検討したが、その過程で効率よく軟骨細胞を分化誘導することが可能となった。そこで本年度は、より効率よく軟骨細胞をES細胞から分化誘導し、さらに変形性膝関節症モデル動物や骨欠損モデル動物への移植を行いその生着と組織学的評価を行った。 B. 研究方法 　マウスES細胞は胎児線維芽細胞とleukemia inhibitory factor(LIF) と共培養することで多分化能を維持したまま継代できる。このES細胞をゲラチンコートディッシュ、あるいはフィブロネクチンコートディッシュ上で様々な濃度のBMP-2、BMP-4とともに培養した。軟骨細胞を特異的に染色するアルシアンブルー染色は常法に従い行った。II型collagenの蛋白発現は免疫組織染色を行った。 膝関節内塩酸投与による変形性膝関節モデルマウスの作成と病変部関節への軟骨細胞移植 　変形性関節症のモデルとして、膝関節内へ1規定塩酸10 (lを注入した。注入後3-7日目に膝関節を回収し、組織学的に検討した。更に、一部の実験ではES細胞より分化誘導した軟骨細胞 1 x 106個を関節内に移植した。移植2週間後、同様に組織学的検討を行った。 骨欠損モデル動物の作成 　マウス大腿骨にドリルを用いて直径1 mmの骨欠損部を作成した。ここにES細胞より分化誘導した軟骨細胞 1 x 106個を移植し、経時的にＸ線写真を撮影した。 （倫理面への配慮） 　動物実験に関しては、実験前の飼育、実験中、実験後にいたるまで科学的かつ倫理的に対処し、動物の苦痛を排除するための麻酔による安楽死等の手法を用いた。 C.研究結果 1.　マウスのES細胞から軟骨細胞の分化誘導 　マウスのES細胞株はマイトマイシンC処理を行ったマウス胎児線維芽細胞上でleukemia inhibitory factor (LIF) と共に培養し継代維持した。20%FCSを含む分化誘導用の培養液中で2?4日間培養することで、浮遊状態で球状のES細胞塊、embryoid body (EB)を作成することができた。その後、EBを0.1%ゲラチンをコートしたプレートに移した後、bone morphogenetic protein (BMP)-2あるいはBMP-4を添加し、28日間培養した。BMP存在下に数日培養することで、EBの一部はプレートに付着するようになった。培養2週間目のEBでは、軟骨細胞に特異的と考えられるアルシアンブルー陽性領域が出現した。それ以降培養を継続することで、EBのアルシアンブルー陽性領域は増大した。この細胞はⅡ型コラーゲン陽性で軟