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第23 期 北京明尼克分析仪器设备中心 2011-9 USLCTM 色谱柱 将正确的工具放入你的LC方法开发工具箱 理解反相分离的选择性 ——HPLC和UHPLC色谱柱选购简介 色谱柱的选择性对色谱峰的分离或分辨有着最重要的影响，可不幸的是，对色谱柱的选择性的理解和利用往 往也是最不充分的。为了提高选择性，方法开发者们常常是将注意力集中在手动选择流动相、操作参数和仪 表装置上。但由于固定相引起的选择性差异更突出，因而可以通过将重点放在柱的选择上彻底地加快HPLC 和UHPLC方法的开发。在本文中，我们讨论了反相分离的色谱柱选择，以及通过使用hydrophobic subtraction 模型(H-S模型)来鉴别一套只有四个固定相—Restek’s USLCTM色谱柱套装—却能涵盖市场上最广选择域的 装置。 选择性在液体分离中的角色 在进行液体分离时，我们一般将注意力放在选择正确的仪表装置上—尤其是在UHPLC出现以后—而在选择 色谱柱时则相当匆忙，要么就近选择(使用已经安装在仪器上的或者触手可及的色谱柱)，要么按习惯选择(使 用以前没有出过问题的色谱柱)，这样往往难以实现最优效果。方法开发者对以上这些情况要格外关心，因 为选择不恰当的色谱柱会导致方法开发工作事倍功半。如果再考虑到色谱柱选择性对于峰分离分辨的影响， 我们就不难明白为何选择正确的色谱柱如此重要了。 分辨是3个累计项的结果：效率(N)、保留能力(k)和选择性(α) 。因此，对物质的分辨水平和速度都取决于我 们对这3个因素的调控能力。在这3个因素中，选择性又在数值上对分辨率具有最大的影响(等式1)，换句话 说，分辨率主要是选择性的函数。 公式 1 选择性是实现分辨率主要驱动因素，它对峰分离的影响程度最大。 R = ¼ x (k/(k+1)) x (α- 1) 效率 保留因子 选择性 更换色谱柱以实现选择性的重大改变 由于分辨率主要是选择性的函数，因此任何关于提高分辨率的讨论都应首先关注可更改的选择性。在HPLC 方法开发中一般认为应该能够通过调整流动相来有效更改选择性从而实现分离，这固然没错，然而流动相调 整工作十分繁复—常常需要大量准备工作和很长色谱柱平衡时间—且只能带来边际的选择性差异。此外，一 些洗脱图不能实际应用于部分流动相和检测模式，包括质谱分析(MS)和折射率(RI) 。 另一方面，改变固定相(亦即色谱柱)要容易得多并且能带来更显著的选择性差异，这是因为固定相能够提供 可更改的甚至正交的分离，通过精确的追踪梯度可以快捷的对这些可更改的分离进行跟踪。 随着当今商用的色谱柱数量日益增多，选择一款正确的色谱柱也越发困难甚至像大海捞针。通过量化固定相 的选择性，我们可以得到一种有效而简洁的选择色谱柱的指导方针并有助于减少方法开发时间和增加方法重 现性。 使用Hydrophobic Subtraction模型(H-S模型)量化色谱柱选择性 很多模型仅用于选择溶剂和流动相添加物，直到最近固定相鉴定才得到更多的关注。色谱柱选择性很大程度 上被忽略部分是由于它本身的复杂性，尤其是用于液体分离时。但现在Snyder等人提出了流行的hydrophobic subtraction模型(H-S模型)[1] ，据此我们可以开始比较和量化反相分离中的固定相选择性并(通常通过正交分 离)判断何种固定相能最大程度和限度的产生选择性差异。直到此时我们才能确认一小套色谱柱能否成为一 个高效用方法开发工具箱的组成部分。 H-S模型是一种新的方法，它按照下述经验定义反相的选择性：首先分析各种各样溶解的测试探针，之后利 用选择性的5个既定参数—疏水性(H)、位阻(S*)、氢键酸度(A)、氢键碱度(B)和阳离子交换活度(C)—来判定 硅吸附剂和固定相对选择性的贡献值。该模型在多个组织，包括美国药典(USP)，用于寻找色谱柱的等效性。 H-S模型选择性值(Fs)一般用来寻找色谱柱间的相似性，不过反之也可将其用于寻找柱间差异，甚至正交差 异以突出选择性差异并简化柱的选择。表 I