好信不信由你1.1.DNA重组技术的基本工具汇编.ppt

噬菌体侵染细菌: 入噬菌体 细菌 吸附 释放 装配 合成 注入 拟核DNA 细菌 环状DNA质粒 G A 磷酸二酯键 限制酶 T T C A … … … … … … … … 限制酶识别序列 ★ EcoRⅠ限制酶： ★ SmaⅠ限制酶： GGG CCC G CTTAA GGG CCC G AATTC 3.限制性核酸内切酶在DNA的任何部位 都能切开吗? CTGCA … 以下是两种不同限制酶切割形成的DNA片段: (1) … … … GC G CG (2) GC … (3) … … … G CG ACGTC (4) 请用DNA连接酶将它们连接起来 和 能连接形成 和 能连接形成 (1) (4) (3) (2) CTGCA … … G … … G ACGTC GC … … CG … … GC CG ★ EcoRⅠ限制酶：GAATTC C G A A T T A T A G T C 限制酶 1.作用： ★ EcoRⅠ限制酶：特定识别GAATTC ★ SmaⅠ限制酶：特定识别CCCGGG 限制酶具有的特性： 识别特定核苷酸序列如 2.切割位置： 两个特定核苷酸之间的磷酸二酯键 3.切割出末端类型： 黏性末端和平末端 4.来源： 原核生物 专一性 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA连接酶 A T A G T C C G A A T T C A A T T DNA聚合酶 G A G T A T C DNA聚合酶 区别： E·coli DNA 连接酶 只能将双链DNA片段互补的粘性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接 T4 DNA 连接酶 既可“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低 DNA连接酶 思考：“寻根问底二” DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？ DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键 不同点 模板 不需要模板 需要DNA的一条链为模板 作用对象 游离的DNA片段 单个的脱氧核苷酸 作用结果 形成完整的DNA分子 形成DNA的一条链 用途 基因工程 DNA复制 目的基因 1.如何解决胰岛素基因导入受体细胞后不能复制的问题？ 2.胰岛素基因使受体细胞死亡，如何解决？ 质粒 1. 质粒是基因工程最常用的运载体， 2.广泛地存在于细菌中，独立于细菌拟核DNA外，很小的环状DNA分子，大小只有普通细菌拟核DNA的百分之一。 3. 能够自主复制 要对天然质粒进行人工改造 目的基因 运载体 你能写出质粒的末端核苷酸序列？ 用切目的基因相同的限制性内切酶切割质粒 目的基因 用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子，即基因表达载体。 能作为基因运载体的条件 1.胰岛素基因单独导入受体细胞后不能复制， 在细菌后代中丢失了，而但以质粒作为载体后？ 2.作为载体没有切割位点将怎样？ 3.胰岛素基因是否进入受体细胞，你如何去察觉？ 4.如果载体对受体细胞有害将怎样？ 作为载体的必要条件 1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存 使目的基因的数目增多并稳定存在 2、具有一至多个限制酶切点 以便与外源基因连接； 3、具有某些标记基因 便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等 ） 4、对受体细胞无害 作用：将外源基因送入受体细胞。