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SPR技术和ITC技术在结构生物学中的应用 摘要 生物大分子的活性是通过不同分子或相同分子之间的相互作用来实现其生物学功能。在结构生物学研究领域中，单纯解析生物大分子的结构已不能满足现代科研的基本要求，所以研究其生物学功能受到了越来越多的重视。本文主要介绍现在常用的SPR技术和ITC技术以及它们在结构生物学中的应用。 结构生物学是前个世纪后半叶才蓬勃发展起来的重要学科，通过研究核酸、蛋白质等生物大分子的空间结构，可以为生物大分子发挥生理功能的机理提供关键解释[1]。生物分子之间的相互作用奠定了生物生命现象的基础，因此研究生物分子之间的相互作用可以在分子水平上更加精细地阐述生物反应发生的机理，揭示生命现象的本质[2]。 关于蛋白质相互作用的检测手段已有很多，但是其缺点也很明显。SPR（表面等离子共振）生物传感技术作为一种新兴的光学生物化学检测技术，与传统的生化分析方法相比，具有无需标记、灵敏准确、快速、能够实现在线连续检测等优点[3]。此外，在生物体中的各种生物分子之间的相互作用并不像化学反应那样剧烈。通过热力学研究，它能够在结合机制的阐明中起重要作用，为药物的设计提供合理的理论模型[4]。为了研究分子间弱的相互作用力，ITC（等温滴定量热分析）技术便应运而生，它在生物热力学模型的建立、蛋白质和配体的结合以及表面活性剂和聚合物的相互作用中都扮演了关键角色[5]。 SPR技术 图1 光学无标记生物传感器插图[7] SPR的实验方法：将需要检测的分子键合到生物传感器的芯片上（该步骤可以委托公司完成），然后将蛋白分子溶液以恒定的流速流过芯片表面。如果检测的分子能够与与蛋白分子相互作用，那么生物传感器表面的质量便会增加，改变传感器表面折射率，从而使共振角度发生改变。折射率每变化1000RU，那么表示芯片表面每平方毫米有1纳克的质量发生改变[8]。 现在实验室广泛使用的表面等离子共振传感器有Biacore系列，它们的光学检测部件一般包括光源、TM波偏振器、棱镜、检测芯片、信号检测器这六个大的部分（图2）。光源发出的光经过透镜后，能产生平行的光束，透过棱镜，再检测芯片上质量的改变情况，最后的反射光经过各级的检测器、放大器进行处理，在记录仪上显示其变化情况。通过系统自带的计算软件，计算反应的平衡常数、解离常数。 图2 光学SPR传感系统[6] SPR在结构生物学中的应用 pM。这一实验，为单克隆抗体在疾病的诊断和试剂的研究提供了基础。 Huang Y等[11]使用SPR研究了RGD-水蛭素与凝血酶的结合常数。实验结果表明，RGD-水蛭素的六个突变体与凝血酶的Kd值高于野生型，这个发现有助于新型的RGD-水蛭素与凝血酶的相互作用的理解。 等温滴定量热法 等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是根据热效应随时间变化特征确定化学反应动力学行为的一种先进的现代测量技术。在类似于化学滴定的过程中，通过测量滴定过程中分子之间热量的释放和吸收，跟踪化学反应的反应热量随着时间的变化而变化[]，ITC技术提供了一个快速、精确地测量分子相互作用的实验方法[]。在单个实验中，ITC技术能够测定分子之间的亲和力常数K，化学计量数N、焓变△H以及反应熵变△S。ITC实验仪器重要由主机和控制器组成。控制器为安装有控制软件的电脑，主机包括塔台，样品注射器，测量池、样品池以及清洗单元等部件组成（图）。40微升的注射器中装配体小分子，样品池为蛋白样品（对ITC200型号的样品池，工作体积为200微升，但是需要向样品池中加入280微升的样品），参比池中通常加入等体积的水。实验开始时，系统给样品池和参比池一个能量，保证两个池子中的温度相等。当注射器中的配体与样品结合的时候，其产生或者吸收了热量，使两个池中的温度平衡被打破。这时系统通过减少能量供给或者增加能量输入，保证两个池中的温度达到平衡，输出的数据即为系统的能量变化情况。实验结果是通过每次滴定过后能量变化的情况，用origin软件进行拟合计算。关于C值。C值的定义是 C=[样品池浓度]×N/D 准确的浓度定量与滴定实验一样重要。如果C值太低，焓变△H和化学计量比N将不准确；小分子实验却通常不得不采用低的C值；假如C值太低，可以通过提高样品池浓度来对实验进行优化。实验证明，如果样品池中浓度超过其KD值的210倍时，低C值的滴定是可靠的[7]。但是，一旦C值过高，由于没有足够的数据点描述综合的饱和过程，因此由数据拟合得到的K值不准确。合适的C值带来理想的拟合曲线。当C值在10-100之间时，我们认为这是一个很好的实验条件。 图3 ITC实验装置图[2] ITC在结构生物学中的应用 蛋白质、核酸等生物大分子不论它们的分子间或分子内的生物化学反应，在反应过程中总会伴随着一定