病毒转基因技术原理 腺相关病毒.ppt

rAAV载体应用于基因校正、基因阻断治疗疾病或生产转基因家畜、用于农业和研究的大型动物等具有无可比拟的优势，如：介导的基因打靶的效率高达1％、高于质粒载体转染或电转化，宿主范围广泛，可利用的多种亚型等。主要缺陷是大约10％仍是随机整合、具有潜在的致死或致癌效应。研究显示可采用成体干细胞并在体外筛选特异打靶克隆用于疾病治疗。 第二部分 基因打靶型腺相关病毒载体 策略3细胞内整合表达 纯化（三种方法） 离子交换色谱法（IEX chromatography）：原理是依据在某一PH条件下，不同血清型的AAV的衣壳蛋白的电荷不同，因而，可以利用这一技术将不同的血清型的AAV分离纯化. 优势:具有快速、规模化、可重复性以及适用于不同血清型病毒纯化的。 缺点: 在于需要摸索盐和PH浓度，以利于AAV病毒颗粒结合于IEX离子柱，而且这些条件依据不同的血清型而有所变化；另外常需要多步骤才能获得高纯度的rAAV。 第三部分 纯化和定量 主要内容 腺相关病毒简介 腺相关病毒载体转基因技术原理 腺相关病毒载体的医学应用 优缺点总结和复习思考题 第一节 腺相关病毒简介 生物学特性 致病性与免疫性 第一部分 生物学特性 血清型 病毒结构 病毒复制 对理化因素的抵抗力 血清型 AAV是从腺病毒的污染物（1965年）、人群或非人灵长类动物等的组织中分离鉴定到的。 共鉴定了11个AAV血清型以及108个AAV变株（variants）。 通过签名PCR（signature PCR）技术，利用高度保守序列扩增Cap基因的一小段可变区的DNA序列，以筛检是否是新的AAV分离株，然后利用PCR技术获得新的AAV分离株的Cap或（和）Rep基因的全长序列。在人类、非人灵长类动物、马、猪、牛、绵羊、山羊和蛇等的不同组织器官，发现了大量的具有多样性的AAV的基因组。但新分离的病毒株，尚未进行血清学分型，通称为变株。 AAV不同血清型和变株的基因组结构相对较为保守，与AAV-2型较为类似，不同血清型的衣壳蛋白结构中表位的差异。50 ~ 80% AAV-2抗体在人群中检测出。 转导不同组织器官的AAV最优血清型 组织 最优血清型 肝脏 AAV-8,AAV-9 骨骼肌 AAV-1,AAV-7,AAV-6, AAV-8,AAV-9 中枢神经系统 AAV-5, AAV-1,AAV-4 肺脏 AAV-9 心脏 AAV-8 肾脏 AAV-2 胰腺 AAV-8 眼睛（光受体细胞） AAV-5, AAV-4 不同血清型在吸附细胞表面能力、病毒受体、胞内交通和抗原性等方面具有明显的区别，以及针对不同组织和细胞的转导效率不一致，体现出不同的组织极性（tissue tropisms） 病毒结构 AAV-2 20–30 nm，基因组为线性、单链的DNA分子。正链和负链的单链DNA分子，以同等效率包装在病毒体衣壳中。基因组全长4679个核苷酸。 基因组包括两个ORF，三个启动子（启动子以在基因组中处的作图位置标示，分别为p5、p19和p40启动子），以及两末端为145个核苷酸的反向末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR） ITR ITR中的前125个核苷酸具有回文结构，其中还存在两个小的内部回文结构，可自身折叠后经碱基配对、形成T字形的发夹结构；剩余的20个核苷酸，保持非配对状态，称为D序列（D sequence）。 ITR中还具有Rep结合元件（Rep binding elements， RBEs) RBE和 RBEˊ ， 以及一个末端解离位点TRS（terminal resolution site）等重要序列。 ITR是在AAV生物学中重要的顺式（cis）作用活性元件，在病毒复制中具有重要作用：在非容许条件下，ITR在病毒复制的负调控中起关键作用；在容许条件下，作为病毒基因组复制的起点和引物。 ITR对病毒基因组的包装、转录、以及位点特异性的整合，均是必需的。 左端的ORF（Rep基因） 可编码四个Rep蛋白，即Rep78， Rep68，Rep52和Rep40，均具有螺旋酶和ATP酶活性。较大的Rep蛋白如Rep78和 Rep68，由P5启动子指导转录，分别由未剪辑和剪辑的转录物产生，具有链和位点特异的核酸内切酶活性（切割点在TRS附近）以及位点特异的DNA结合活性（结合于RBE）。因此它们是重要的调节蛋白，以反式（trans）方式参与调节AAV复制周期的所有阶段，如 DNA复制、位点特异性整合、整合病毒基因组的拯救，调节病毒和细胞内基因表达的启动子等。 较小的Rep蛋白如Rep52和Rep40，由P19启动子指导转录，分别由未剪辑和剪辑的转录物产生，参与单链DNA的聚集并包装入病毒体的衣壳。 右端的ORF（Cap基因） 由P