直接分子克隆法构建重组缺陷型腺病毒AdHu5 - 第三军医大学学报.DOC

直接分子克隆法构建重组腺病毒AdHu5-mfsp27基因及其扩增与纯化 王 群 1 贾 蓓 (1 魏晓宇1 黄文祥1 周向阳2 （1重庆医科大学附属第一医院感染科，重庆市传染病寄生虫病学重点实验室，重庆400016 2 美国Wistar研究所病毒载体中心, 费城 美国 19104） 【摘要】 目的 采用直接分子克隆体外连接的方法构建重组腺病毒AdHu5-040-mfsp27 (cds) 高效高质量扩增和纯化重组腺病毒以满足体内外实验以及临床试验的需求。方法mfsp27首先克隆到穿梭质粒pSh CMV intron-eGFP并位于两个稀有限制性内切酶之间（I-ceuI and PI-sceI）（与腺病毒骨架质粒相同），回收酶切片段后连接，用适合的感受态细胞转化后氨苄青霉素抗性挑选克隆，用2到3种合适的限制性内切酶证实重组腺病毒质粒骨架和目标基因的的大小，方向，必要时测序。然后线性化该重组腺病毒以释放腺病毒载体基因组的反向末端重复序列（ITRs），在HEK293细胞系转染，感染，扩增。改良氯化铯梯度离心法纯化病毒并测定病毒的滴度。结果 构建成功pAdHu5-mfsp27（cds）（J1034），AdHu5-mfsp27经扩增后的滴度(O.D.)为1×1013VP/mL; MOI为1.44×1011，二者比值为69.44。重组腺病毒AdHu5-mfsp27可高效感染293包装细胞，提示该重组腺病毒具有很高的活力。结论 直接分子克隆的方法构建重组腺病毒AdHu5-mfsp27（cds）并高质量扩增，解决了用同源重组的方法构建时难于挑选克隆，时间长成功率低的问题；利用高效液相柱，生物胶联合氯化铯梯度离心技术纯化病毒，简化操作不需透析病毒，最大程度保存病毒活性，纯度高, 为下一步进行体内外试验研究该基因的功能以及真正实现重组腺病毒产业化提供可靠的实验室依据。 【关键词】直接分子克隆；重组缺陷型腺病毒AdHu5-mfsp27；扩增；纯化 中图分类号：R373；Q7；R45 文献标志码：A Direct Molecular Cloning to Construct Recombinant AdHu5-mfsp27 and its Amplification and Purification 【Abstract】 Objective: The aim of this study was to construct recombinant AdHu5-040-mfsp27 (cds) using direct molecular cloning method and obtain high titer and purity of viruses for laboratory and clinical trials. Methods: The targeted gene mfsp27 was first cloned into pShuttle and located between two rare restricted enzymes (REs) (I-ceuI and PI-sceI). After digestion, gel ligation and transformation, recombinants were selected and confirmed by specific REs cutting and sequencing. The candidate recombinant plasmid was then linearized and rescued in HEK293 cells. After infection and expansion, the virus crude stocking was collected and purified by modified cesium chloride gradient centrifugation method. The virus multiplicity of infection (MOI) was measured by series dilution of the stocking. Results: Recombinant AdHu5-040-fsp27 (cds) was successfully constructed. The titer (O.D. measurement) was as high as to 1×1013VP/mL and MOI was 1.44×1011. The ratio of the tow values was 69.44. The recombinant virus had potent a