发育期大鼠反复高热惊厥激活内质网应激详解.pdfVIP

发育期大鼠反复高热惊厥激活内质网应激1 刘晓燕，秦炯，杨志仙，韩颖，陈静 北京大学第一院儿科，北京（100034 ） E-mail ：qinjiong@263.net 摘 要：目的研究反复高热惊厥（febrile seizures ，FS ）对发育期大鼠ACTH 及葡萄糖调节 蛋白78 （glucose-regulated protein 78 ，Grp78 ）的影响，探讨FS 与内质网应激的关系。方法 40 只21 日龄SD 大鼠，采用热水浴诱导大鼠惊厥，隔日1 次，共10 次。大鼠随机分为两 组: 正常对照组和高热组, 根据惊厥与否进一步将高热组分为高热对照组和反复 FS 组。采 用放射免疫分析法测定各组大鼠血浆中 ACTH 水平，用免疫组织化学法和蛋白免疫印迹 (Western blotting) 检测各组大鼠大脑皮层和海马神经元Grp78 蛋白的表达水平。结果 与对 照组和高热组比较，反复FS 组大鼠血浆ACTH 水平显著升高（P ﹤0.01 ），皮层及海马Grp78 蛋白表达也明显增强。结论 反复FS 可引起下丘脑-垂体- 肾上腺皮质轴（HPA ）激活，诱导 脑内Grp78 蛋白表达增加，导致内质网应激。 关键词：高热惊厥，葡萄糖调节蛋白78 ，内质网应激 癫痫是小儿时期最常见的慢性神经系统疾病之一[1]，以反复惊厥发作为特点。当惊厥反 复发作而未能很好控制时，有导致进行性脑结构（如海马）损伤的危险，并且可能造成认知 的损害[2-3] 。 我们课题组借鉴国外文献[4]，建立了热水浴诱导发育期大鼠高热惊厥（febrile seizures， [5]，应用此模型证明单次惊厥发作后，大多数发育期大鼠脑功能和结构良好，而 FS ）的模型 反复 FS 大于 6 次即可造成脑损伤[5-6] 。目前惊厥性脑损伤的发病机制尚不明了。最近的研究 表明，内质网应激在许多神经系统疾病特别是神经退行性疾病的发病机制中可能起着重要作 用[7] 。机体处于应激状态时，下丘脑-垂体- 肾上腺皮质轴（HPA ）常发生相应的改变；在整 体应激出现明显改变之前，在细胞的亚细胞器水平和分子水平可能已经发生了应激相关分子 的改变。葡萄糖调节蛋白 78 （glucose-regulated protein 78，Grp78 ）为内质网的标志分子伴 侣，广泛存在于各类哺乳动物细胞的内质网腔中[8-9]，在内质网应激状态下，它的表达上调， 以维持细胞内环境的稳定。 本研究应用热水浴诱导大鼠惊厥模型，观察反复FS前后大鼠血浆ACTH水平及脑组织 Grp78蛋白表达的变化, 来探讨反复FS 时是否存在整体应激及内质网应激，以期揭示内质网 应激与惊厥性脑损伤可能的相关性。 1． 材料与方法 1.1 反复高热惊厥动物模型的建立和实验分组 21 日龄SD大鼠（购自维通利华）40只，雌雄各半，体重50～70g 。随机分为正常对照组 （n =12 ，37.0℃水浴）和高热组（n = 28 ，44.8 ℃热水浴）。 大鼠在热水浴中5 min如果不 发生惊厥则到时取出，5 min 内发生惊厥者则惊厥开始即刻取出, 隔日热水浴处理1次，共10 次。高热组又按大鼠惊厥与否进一步分为高热对照组（n=12 ）和FS组（n=16 ）。 1.2 标本的取材和制备 1本课题得到国家自然科学基金项目（No. ）；北京市自然科学基金项目（No.7063096 ）；教育部 高校博士点基金项目（No.20040001114 ）的资助。 - 1 - 所有大鼠在最后一次水浴处理后8 h左右取材。腹腔注射10%水合氯醛麻醉,经腹主静脉 取血2 ml ，注入含10%EDTA二钠30 µl和抑肽酶20 µl 的试管中，混匀，4 ℃离心10 min （3000 rpm/min ），分离上清，编号，置-20℃冰箱保存，用于测定ACTH