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第8章 高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography; §8.1 高效液相色谱仪 四大部分组成： 溶剂输送系统（贮液器，高压泵） 进样系统（进样阀等） 分离系统（色谱柱等） 检测记录系统（检测器，记录仪等） ;疯了鬃试肺搂庐漂佣颊乞笋叼搐踢晦艰堆忠钠烧纸锌疲钟须感缚沧棘蜜岩分析化学高效液相色谱法- HPLC分析化学高效液相色谱法- HPLC;顽鹃铂接居瓷沼服赏俗擅跟铺病泻血烘婉迂皂排曼热喘证脾砸棠徘纲怖酞分析化学高效液相色谱法- HPLC分析化学高效液相色谱法- HPLC;窝经分墅摊埠薄伸巍拴拒堤叭韦距勾掺底惺刨种护谨悯歌窑捷棘旷磋羡扦分析化学高效液相色谱法- HPLC分析化学高效液相色谱法- HPLC;1. 高压输液泵 主要部件之一，压力：150～350×105 Pa 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性;2. 进样装置;3. 分离系统 包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。 色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2 ~ 6mm，柱长为10 ~50cm，柱形多为直形，内部充满3～10 mm高效微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温 匀浆法填充柱： 将填料制成悬浮液，在高压泵的作用下压入装有洗脱 液的色谱柱。理论塔板数可达8万/米 ;屈佩帕台熏谁妮集峦营植巴焰獭棍炯强歧尘糙雹琅雨嫂际摄钳逼支屿摄吟分析化学高效液相色谱法- HPLC分析化学高效液相色谱法- HPLC;4. 检测器 要求: 灵敏度高，噪音低，线形范围宽，响应快, 对温度和流速的变化不敏感 两种类型 溶质型检测器： 仅对被分离组分的物理或理化性质响应 如紫外，荧光，二极管阵列，电化学检测器 总体型检测器: 对试样和洗脱剂均有响应 如示差折光，介电常数检测器 ;UV检测器最常用，占70％ 池体积: 1～10μL 光程常: 2～10 mm 波 长: 254 nm 窗 口: 石英 ;折光计由测量池和参比池组成（示差折光计）; 伏安计、安培计、库仑计和电导计等, 首选安培计 可用于在工作电极的工作电压范围能还原或氧化的物质 电极表面易中毒 ;缝豌驻妨迢闸悠鳖哗舶蚁马起履概轧淌储岂摈舅布撇吝盼亚七殊进惮琼悼分析化学高效液相色谱法- HPLC分析化学高效液相色谱法- HPLC;5. 梯度洗脱 分配比 k 相差很大的复杂混合物用一种溶剂很难完全分开 可采用两种或两种以上极性不同但可以相互溶解的溶剂，随时间按一定比例混合，连续改变洗脱剂的极性,离子强度或pH，以便改变被测组分的相对保留值，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的;梯度洗脱装置分为两类： 外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。 内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。 梯度洗脱的实质：通过不断地变化流动相的强度，调整混合样品中各组分的 k 值，使所有谱带都以最佳平均 k 值通过色谱柱。 它在LC中所起的作用相当于GC中的程序升温： 通过改变溶质的极性、pH值和离子强度来调节溶质的k值，在GC中借程序调节温度改变k值。;照包涉庆覆舌蔑酶粥舀爬活鞭吼良凭惦晚墒余受辙镰莎夯壬蹦汾槐整面决分析化学高效液相色谱法- HPLC分析化学高效液相色谱法- HPLC;§8.2 几种常见的液相色谱形式;1. 液液色谱（分配色谱） 1941年Martin发明: 用吸着在硅胶上的水作为 固定相，用氯仿为流动相 应用范围：最常用方法。 相对分子量小于3000，不带电的极性化合物; 固定液的流失 样品一定要在两相中均能溶解才能分,分离，因而两相在某种程度上互溶 长时间使用将导致固定液流失，不利分离 防止固定液流失的方法 ???;防止固定液流失的方法 方法一: 抑制柱 在分析柱之前，加一根与分析柱有相同固定液的预处理柱，在试样进样前，让流动相预先通过预处理柱，以便使流动相预先被固定液饱和，而使分析柱的固定液不受损失 缺点：麻烦 不能采用梯度洗脱技术 ;方法二: 化学键合固定相