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经典遗传开放式实验——果蝇诱变 时间：三月份——五月份 四人一组 自由设计并合作完成 果蝇诱变实验设计 实验目的：采用物理法、化学法、生物法等多种实验手段，使果蝇发生诱发突变，通过其遗传现象找出突变的规律和特点。学会自主设计实验，培养独立思考和团队合作精神，模拟科研训练。 实验材料： 黑腹果蝇(Drosophila ) 物理诱变剂的种类 典型的物理诱变剂是不同种类的射线，常见的有X射线，r射线和中子，此外还有紫外线和β射线。 X射线是种波长为1000－100埃的电离射线，是最早的诱变射线。 r射线是一种波长更短的电离射线，其波长0.1－1埃，60CO和137CS是目前应用最广的r射线源。 中子是不带电粒子，在加速器或核反应堆中得到能量范围极广的中子。252Cf自发裂变中子源可应用诱发突变。 β射线是电子或正电子的射线束，由32P和35S等放射性同位素直接发生的。透过植物组织能力弱，但电离密度大。当同位素溶液进入组织和细胞后作为内照射而产生诱变作用。 诱变机理 X射线和r射线都是能量较高的电磁波，能引起物质的电离。当物体的某些较易受辐射敏感的部位受到射线的撞击时，而发生离子化，可以引起DNA链断裂，当修复时不能恢复到原状就会出现突变。如果射线击中染色体则可能导致断裂，在修复时可能造成缺失、重复、倒位和易位等染色体畸变。中子不带电，但当与生物体内的原子核撞击后，使原子核变换产生r射线等能量交换，从而影响DNA和染色体的改变。 诱变方法 一般采用r圃，以60CO源为中心种植多种处理材料，并按材料材料与60CO源中心距离和照射时间来控制照射剂量。这种r圃对于诱变育种的应用不是十分合适的，但作为植物对辐照的效应以及辐射生物学等理论研究是十分有意义的。一般设设置较小的60CO室进行处理。除了处理植株或植株的局部，也可以处理种子以及花粉。处理花粉的优点是产生突变不至于形成嵌合体，但花粉的存活时间短暂不易进行处理。（目前，这个问题似乎可以解决。根据赵永亮（1998）年花粉离体培养结果表明，玉米新鲜花粉可在常温下储存在液体石蜡油中2.5小时,而对其花粉活力没有影响。） 化学诱变剂种类 早在1948年，Gustafsson等曾用芥子气处理大麦获得突变体。1967年Nilan用硫酸二乙酯处理大麦种子育成了矮秆、高产品种Luther。此后化学诱变剂的以及和应用就逐渐发展起来。目前较公认的最有效和应用较多的是烷化剂和叠氮化物两类。烷化剂中仍以甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)和乙烯亚胺(EI)等类型的化合物应用较多，叠氮化合物则以叠氮化钠(NaN3 )研究和应用较多。 化学诱变剂诱变机理 烷化剂 指具有烷化功能的化合物,带有一个或多个活性烷基,该烷基转移到一个电子密度较高的分子上,可置换碱基中的氧原子，碱基被烷化后，DNA在复制时会导致配对错误，产生突变。 叠氮化钠 一种动植物的呼吸抑制剂，可使复制中的DNA的碱基发生替换，从而导致突变体的发生，是目前诱变率高而安全的一种诱变剂。 化学诱变剂的处理方法 利用化学诱变剂处理种子较为普遍，其方法是直接把种子浸泡在含有化学试剂的溶液中，可以诱发各类体细胞突变。一般来说，玉米种子的处理效果较差，因为成熟的玉米籽粒胚中具有分开的、已定型的雄花和雌穗原基细胞，并且在突变发生过程中容易产生细胞间的竞争，使突变细胞受到抑制或消亡，被排斥在生殖过程之外。 化学诱变剂的处理方法 用含有化学药剂的石蜡油处理玉米花粉是目前已知的最有效的方法。以EMS为例，具体的处理方法步骤如下：用EMS与轻质石蜡油混合，制备成浓度为0.1-0.2%EMS处理液；在适当的时间，收集玉米新鲜花粉，在一个带盖的瓶中，把花粉与EMS处理液混合；最后用一把小号毛刷，把被处理花粉涂到选好的雌穗花丝上。 化学诱变剂的特点有： 诱发突变率较高，而染色体畸变较少，并且诱变范围广。 对处理材料损伤轻，有的化学诱变剂只限于DNA的某些特定部位发生变异。 大部分有效的化学诱变剂较物理诱变剂的生物损伤大，容易引起生活力和可育性下降。 诱变育种的一般步骤 处理材料的选择 诱变剂量的选择 用60CO-r射线辐照自交系时，剂量为135-190Gy，辐照杂交种时，剂量为200-320Gy为宜。 UV处理？分钟 在EMS化学诱变处理45分钟的条件下，以1-2×10－3浓度为宜。 叠氮化钠10μg/ml ? M1、M2、M3突变性状与选择 * * 厦门大学生命科学学院 遗传与分子生物学实验课 参考资料 参考资料 参考资料 参考资料 参考资料 参考资料 参考资料 参考资料 参考资料 *