蛋白穿越重现之旅western blot技术 - 全式金.pdf

蛋白穿越重现之旅蛋白穿越重现之旅 ——WesternWestern BlotBlot技术技术 北京全式金生物技术有限公司 WWestern Blotestern Blot的起源和应用及原理的起源和应用及原理的起源和应用及原理的起源和应用及原理 Western Blot实验流程详解Western Blot实验流程详解 Western Blot实验中的常见问题分析Western Blot实验中的常见问题分析 • WWestern BlBlot 蛋白质印迹法蛋白质印迹法 • 又称免疫印迹试验，它是分子生物学、生物化 学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 • 基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过 的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着 色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析 色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析 的细胞或组织中表达情况的信息。 Western Blot起源起源 • Renart, J., J. Reiser, G. R. Stark, (1979). Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studyyingg antibodyy sppecificityy and antiggen structure. Proc Natl Acad Sci U S A 76(7): 3116-20. •• DNADNA杂交技术杂交技术 ，SouthernSouthern BlotBlot • RNA杂交技术，Northern Blot 1977 • 蛋白质印迹技术，Western Blot 1979 Western Blot 的应用 Western Blot 的应用 • 定性或半定量分析目的蛋白的特异性表达定性或半定量分析目的蛋白的特异性表达 • 蛋白‐蛋白、蛋白‐DNA和蛋白-RNA相互作 用的后续分析 • 蛋白修饰的鉴定 （磷酸化 糖基化的鉴定 ） • 蛋白修饰的鉴定 （磷酸化 、糖基化的鉴定 ） Western Blot实验原实验原理 • 直接法 • 间接法 WWestern Blotestern Blot的起源和应用及原理的起源和应用及原理的起源和应用及原理的起源和应用及原理 Western Blot实验流程详解Western Blot实验流程详解 Western Blot实验中的常见问题分析Western Blot实验中的常见问题分析 Western Blot实验流程 Western Blot实验流程 样品制备及定量 SDS转膜 显色发光 抗体杂交 封闭 样品制备及 SDS- 转膜转膜 定量 PAGE 电泳 显色 抗体杂交 封闭 样品制备 • 总体原则总体原则 – 整个提取过程在低温下进行，保持蛋白处于溶 解状态解状态 ，防止蛋白变性防止蛋白变性、降解与修饰降解与修饰。 – 根据实验目的选取不同抽提液和抽提方法。 有时需要去除体系中的核酸、无关蛋白等干扰成分 – 方法简便，耗时短，易于操作。 – 制备好的样品若不立即使用，需分装冻存于- 8080℃冰箱冰箱 ，，及防止储存过程中降解及防止储存过程中降解。。