微生物原生质体融合2资料.pptVIP

第十二章 工业微生物原生质体融合育种 与常规杂交相比，原生质体融合具有以下优势： 1. 大幅度提高亲本之间重组频率（10-1） 2. 扩大重组的亲本范围（远缘间产生融合子） 3. 原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲本优良性状的机会更大。 三、原生质体融合 (一) 原生质体融合过程 霉菌：两亲株原生质体混合于高渗稳定液中?在PEG的诱导下，两个或两个以上凝聚成团?相邻原生质体紧密接触的质膜面扩大，相互接触的质膜消失?细胞质融合，形成一个异核体细胞?异核体的细胞在繁殖过程中发生核的融合，形成杂合二倍体?通过染色体交换，产生各种融合子(fusant)。 (二) 原生质体融合的影响因素 1. 融合剂 化学融合剂：PEG，分子量4000～6000 物理融合剂：电场和激光 2. 温度 3. 亲株的亲和力和原生质体的活性 4. 无机离子 5. 其他条件 (二) 融合体的检出与分离 原生质体融合后产生两种情况，一种是真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体；另一种是暂时的融合，形成异核体 。两者均可以在选择培养基上生长，一般前者较稳定，后者不稳定，会分离成亲本类型，有的甚至以异核状态移接几代。因此，要获得真正的融合子，必须在融合原生质体再生后，进行几代自然分离和选择，才能加以确定。 1. 利用营养缺陷型标记选择融合体 2. 利用抗药性选择融合体 3. 用灭活原生质体检出融合体 4. 利用荧光染色法选择融合体 5. 双亲对碳源利用不同而检出融合体 6. 融合体的其他选择方法 五、融合重组体检出与遗传特性分析 (一) 重组体的检出和鉴别的方法 1. 直接法 (二) 融合率 (三) DNA含量及孢子形态测定 重组体的进一步鉴定 1. DNA含量测定 2. 单倍化 3. 有关酶活性及孢子体积测定 4. 分子生物学方法 六、原生质体融合的应用 1. 提高产量或质量，合成新物质 2. 改良菌种遗传特性 3. 优化菌种发酵特性 4. 质粒转移 5. 原生质体与细胞核融合 6. 进行遗传分析 第二节 细菌原生质体融合育种 一、概述 1. 细菌类型和细胞壁特点 二、细菌原生质体融合育种一般程序 三、细菌原生质体融合育种技术 (一) 培养基与溶液 1. 常用培养基 2. 高渗溶液 (二) 细菌原生质体融合育种 1. 提高细菌原生质体制备率和再生率的方法 (1) 预处理：EDTA、表面活性剂 (2) 溶菌酶 (3) 细菌生理状态 (4) 培养基组成与培养条件 2. 建立最佳融合体系 3. 重组子分离模型 第二节 放线菌原生质体融合育种 一、放线菌细胞壁组成、结构及水解 (一) 细胞壁组成和结构：类似于G＋菌 (二) 细胞壁水解 1. 水解酶 2. 酶解环境条件 二、放线菌原生质体融合育种技术 (一) 培养基与溶液 (二) 菌体培养及预处理 (三) 原生质体制备 (四) 原生质体再生 (五) 原生质体融合与再生 (六) 融合体的检出 第三节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母菌细胞壁结构和遗传标记 单细胞真核微生物 二、酵母菌原生质体融合育种技术 (一) 出发亲本菌株的筛选及单倍体分离 (二) 酵母菌原生质体融合常用培养基与溶液 (三) 原生质体制备：蜗牛酶 (四) 原生质体再生 (五) 酵母菌原生质体融合 (六) 融合重组体鉴定与遗传分析 二、培养基及溶液 三、霉菌原生质体融合分关键步骤 (一) 霉菌原生质体制备：多种水解酶 (二) 原生质体再生 (三) 原生质体融合和再生 (四) 融合重组体分析与鉴定 第五节 工业微生物基因组改组育种