失巢凋亡与乳腺癌细胞转移有关的蛋白质组学研究.pdfVIP

贵阳医学院 2011 届硕士论文 失巢凋亡与人乳腺癌细胞转移有关的差异蛋白质组学研究 专业：营养与食品卫生学 研究生：施磊 导师：孙晓红 沈立明 摘要： 目的 （1）建立人乳腺癌细胞MCF-7的体外失巢模型，利用差异蛋白质组学方 法研究失巢培养与贴壁培养的MCF-7细胞的蛋白表达变化，了解失巢凋亡在肿瘤 细胞转移过程中的分子机制。（2 ）探讨“嵌入式死亡”在MCF-7细胞失巢过程中 的作用及其相关分子信号。 方法 （1）采用阴离子聚合物Poly-HEMA(多聚2-羟乙 基甲基丙烯酸脂)包被的六孔板对MCF-7细胞进行多轮悬浮培养，利用流式细胞仪 以及激光共聚焦显微镜，采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法观察非失巢组和失巢组的 细胞凋亡率以及细胞形态变化，确定失巢培养 “驯化”终点，获得具有高抗失巢 凋亡特性的MCF-7细胞作为后期实验细胞。收获失巢终点的MCF-7细胞及正常贴壁 MCF-7细胞，并提取总蛋白，进行双向凝胶电泳 （2-DE ）与基质辅助激光解吸电 离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)检测，鉴定表达差异的蛋白质点并选 取部分进行免疫印迹验证，并以高转移特性的肿瘤细胞作为阳性对照。（2 ）失巢 驯化MCF-7细胞，收集每轮次培养6h的细胞并采用CellTracker细胞示踪染料进行标 记，激光共聚焦显微镜检测细胞内化率。选择细胞内化率最高的第一轮失巢培养 MCF-7细胞分为非内化组（失巢培养0h ）和内化组（失巢培养6h ），收获细胞并 提取总蛋白进行2-DE分离与MALDI-TOF/TOF-MS质谱检测，鉴定表达差异的蛋白 质点并选取部分进行免疫印迹验证。 结果 （1）经过失巢驯化后MCF-7细胞抱团 生长, 第一轮至第四轮失巢培养的MCF-7 细胞凋亡率分别为40.62±5.35% ， 23.94±7.78%，17.78±3.92%，15.70±3.82% 。前三轮细胞凋亡率逐渐降低（P0.05 ）。 第四轮与第三轮的细胞凋亡率差异无统计学意义，确定第三轮为失巢驯化终点。 差异蛋白质组学分析鉴定出8个差异表达蛋白质点，在细胞中分别参与蛋白折叠、 细胞周期与增殖、糖酵解等过程，选取ω-酰胺酶NIT2 （Omega-amidase NIT2），埃 兹蛋白（Ezrin ），人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2 ， HER-2)进行免疫印迹验证，与质谱结果吻合。（2 ）细胞示踪染色法检测MCF-7细 胞经过第一至第三轮失巢培养6h后细胞内化率分别为32.50 ±9.60%、24.40 ±8.60% 和14.70±6.90%，内化率随着失巢轮数的增加而逐渐下降(P0.05) 。分别提取内化 组与非内化组率细胞总蛋白进行2-DE分离和MALDI-TOF/TOF-MS质谱鉴定，鉴定 出18个差异表达蛋白质点，在细胞中分别参与蛋白酶解、细胞周期与增殖、氧化 3 贵阳医学院 2011 届硕士论文 还原等过程。选取组织蛋白酶-D(CTSD) ，局部粘着斑激酶(Focal Adhesion Kinase， FAK) ，上皮细胞粘连蛋白（E-cadherin ），Rho样小GTP 酶（Rac1 ）进行免疫印迹 验证，与质谱结果吻合。结论 （1）成功建立人乳腺癌MCF-7细胞体外失巢模型， 经过驯化后的肿瘤细胞抗失巢凋亡能力提高，NIT2 ，Ezrin ，HER-2在失巢培养与 正常贴壁培养过程中的表达有差异，可作为进一步探讨乳腺癌恶化或转移的靶向 蛋白标志物。（2 ）肿瘤对“嵌入式死亡”的抵抗能力增强可能是肿瘤恶化或转移 发生的机制之一。CTSD ，FAK ，E-cadherin ，Rac1 的表达变化可能对嵌入式死亡 （Entosis ）的发生起到重要作用。 关键词： 人乳腺癌MCF- 7 细胞 蛋白质组学 失巢凋亡 嵌入式死亡 1.前言 失巢凋亡(Anoikis)是一种程序性死亡，是细胞凋亡的特殊形式。正常细胞生长 时相互之间形成联系，紧密粘附于细胞外基质，形成赖以生存的“家巢”，一旦它 们脱离“家巢”则会发