核酸化学(理化性质).pptVIP

第八章 核酸化学 第一节.核酸概述 第二节.核酸的结构 第三节.核酸的物理化学性质 第四节.核酸的研究方法 ③介质中的离子强度 离子强度较低，DNA溶解温度较低，且溶解温度范围较宽。离子强度较高，DNA溶解温度较高，且溶解温度范围较窄。故DNA不应保存在极烯的溶液中。 ④pH值的影响 高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力。 ⑤变性剂的影响 如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。 由于RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有DNA那样明显。 具体：变性曲线不那么陡，Tm值也较低。 利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。 例如，天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸收(260 nm)值增加25－40%. 而RNA变性后，约增加1.1%。这种现象称为增色效应. 3.RNA的变性 变性后的核酸在260nm处的紫外吸收明显升高，称增色效应。核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（减色效应）。 这是检测核酸变性的一个最简便的方法。 思考：增色效应的原因？ 当核苷酸摩尔数相同时，A260值大小如下关系：单核苷酸单链DNA双链DNA 4. 增色效应的原因(P508) DNA复性的定义 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。 减色效应： DNA复性时，其溶液OD260降低。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。退火温度＝Tm－25℃ 目 录 (2) 核酸的复性(P508,掌握) DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。 复性影响因素：分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。 影响复性速度的因素： （1）溶液温度的高低 （Tm – 25℃） （2）单链片段的大小 （3）单链片段浓度 （4）片段内重复序列的多少 （5）溶液离子强度的大小 附：DNA的复性一般只适用于均一的病毒和细菌的DNA，至于哺乳动物细胞中的非均一DNA，很难恢复到原来的结构状态。这是因为各片断之间只要有一定数量的碱基彼此互补，就可以重新组合成双螺旋结构，碱基不互补的区域则形成突环。 复性速度的因素影响：顺序简单的DNA分子比复杂的分子复性要快； DNA浓度越高，越易复性；此外， DNA片断大小、溶液的离子强度等对复性速度都有影响。 复性后DNA的表现：物理化学性质能得到恢复，如紫外光吸收值下降，粘度增高，比旋增加，生物活性也得到部分恢复。 DNA复性 A.概念:在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex) 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交 1.核酸分子杂交的概念和原理(了解) (3) 核酸的分子杂交(hybridization) 简单来说：在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成氢键，或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程。 可形成DNA—DNA双链分子； DNA—RNA双链分子； RNA—RNA双链分子。 B.原理:是只要两种单链分子之间存在着一定程度的同源性，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以按照碱基互补配对原则，在不同的分子间退火形成杂化双链。 DNA-DNA 杂交双链分子 变性 复性 不同来源的DNA分子 核酸的杂交 探针：如果杂交的一条链是人工特定（已知核苷酸顺序）的DNA或RNA的序列，并经放射性同位素或其它方法标记，称为探针（probe)。 探针：用放射性同位素标记的DNA或RNA片段。 利用杂交方法，使“探针”与特定未知的序列发生“退火”形成杂合体，即可达到寻找和鉴定特定序列的目的。用“探针”来寻找某些DNA或RNA片断，已成为目前基因克隆、鉴定分析中十分重要的手段。 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。 杂交可以在液相或固相上进行。 固相杂交 Southern 杂交（Southern bolting） Northern 杂交（Northern bolting） Western 杂交 （Western bolting） 原位杂交技术：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸所在的位置。 Southern印迹法：将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进