植物生物学实验植物种子生命力的快速测定.pptVIP

实验十、种子生命力的快速测定 南京师范大学 生命科学学院 植物生物学实验（二） 种子生命力 指种子的萌发能力。 种子生命力测定的常规方法 发芽实验、浮力实验 种子生命力快速测定的常用方法 BTB法、 TTC法、 红墨水法 以及荧光法、纸上荧光法、电导率测定法、冷冻测定法等 二、知识背景 三、测定方法 BTB法 TTC法 红墨水法 荧光法 1、BTB法——原理 凡活细胞必有呼吸作用，吸收空气中的O2，放出CO2。CO2溶于水成为H2CO3，H2CO3解离成H+和HCO3-，使得胚周围环境的pH值降低，可用酸碱指示剂溴麝香草酚蓝（BTB）来测定pH值的改变。 颜色变化越明显则表明种子活力越强。死细胞没有呼吸作用，也没有BTB的颜色变化。 BTB法——试剂 0.1% BTB 溶液： 0.1g溶解于煮沸过的自来水100mL中，用滤纸滤去残渣。溶液若呈黄色，可滴加稀氨水或NaOH溶液，使之呈现蓝色或蓝绿色，棕色试剂瓶中保存。 BTB琼脂凝胶：取1g琼脂煎碎后加入100mL 0.1%BTB溶液中，用小火加热并不断搅拌。待琼脂完全溶解后，趁热倒在干燥洁净的培养皿中，使之为一均匀的薄层，冷却后备用。 BTB法——材料与设备 恒温箱、培养皿、小麦或绿豆 BTB法——步骤 浸种：将待测种子在30℃温水中浸种24h。 倒平板：取预先加热融化的BTB琼脂凝胶倒入培养皿，静置冷却，使之形成凝胶薄层。 显色：取吸胀的种子，整齐地将胚向下埋于准备好的BTB琼脂凝胶培养皿中，间隔距离在1cm左右。然后将培养皿置于恒温培养箱中30-35℃培养1h。 BTB法——步骤 1h后，记数种胚附近出现的黄色晕圈的活种子数，计算活种子的百分率。 2、TTC法——原理 凡是有生命活力的细胞均具有呼吸作用，从而都有氧化还原反应，而死细胞则无此反应。 TTC（氯化三苯四氮唑）可渗入种胚的活细胞内，并作为氢受体被辅酶（NADH2或NADPH2）上的氢还原，此时无色的TTC便转变为红色的TTF（三苯基甲曁），并吸附在活细胞的表面，根据活细胞着色的深浅可定性的判断种子活力的有无与大小。 该方法在国际间、地区间交换种子最为常用。 注意：染色部位为生活种子的胚细胞。 TTC法——试剂 0.5%TTC溶液：0.5gTTC（酒精溶解后）定容至100ml， 棕色瓶4℃保存。 若溶液变成红色，表示已被氧化不能再用。 TTC法——材料与设备 恒温箱、培养皿、玉米种子、刀片 TTC法——步骤 浸种：同BTB法。 显色：取吸胀的种子适量，用刀片沿胚的中心线纵切为两半，将每一种子的半粒置于培养皿中，另半粒待用。 加入适量的0.5%TTC溶液（以浸没种子为度），置于30℃恒温箱中；1h后，倒去染色液，观察现象。 计算活种子的百分率。 将待测种子在30℃温水中浸种24h。 3、红墨水法——原理 活细胞的原生质膜具有选择透性，红墨水中的染色成分大红G不能进入细胞；因而胚不被红墨水染色。 死亡的种胚细胞原生质膜丧失选择透性，大红G进入胚细胞并染色。 注意：生活种子的胚细胞不染色。 红墨水法——试剂 5%红墨水：以市购红墨水为原液，用自来水配制成5%的红墨水溶液 红墨水法——材料与设备 恒温箱、培养皿、玉米种子、刀片 红墨水法——步骤 浸种：同BTB法。 显色：将TTC法中剩余待用的一半种子置于另1只培养皿中，加入适量的5%红墨水液（以浸没种子为度）。 15min后倒去红墨水，用自来水冲洗多次，直至冲洗液为无色为止。观察现象，判断种子活力的有无和大小。 计算活种子的百分率。 将待测种子在30℃温水中浸种24h。 红墨水法 活种子 死种子 4、荧光法——原理 植物种子中常含有一些物质，能在紫外线照射下产生荧光，如黄酮类、香豆素类、酚类等。在衰老过程中： 荧光物质的结构、成分往往发生变化，因而改变荧光的颜色。可借助直接观察荧光来鉴定种子的生命力。——适用于禾谷类、松柏纲等植物的种子。 细胞膜透性增加，导致浸种后荧光物质外泄，可通过观察荧光物质的渗出情况判断种子的生命力。——适用于十字花科植物的种子。 荧光法——材料与仪器 玉米种子。 紫外光灯，不产生荧光的滤纸。 荧光法——步骤 随机取20粒种子，用刀片将玉米种子沿中心线切为两半，使其切面朝上放在滤纸上，置于紫外光灯下照射观察。 有生命力的种子将产生明亮的蓝色、蓝紫、蓝绿 色荧光。死亡种子往往呈黄色、褐色，并暗淡无光。 观察、计数，计算活种子的百分率。 荧光法 观察孔 紫外分析仪 电源 选择波长 思考题 1、试比较TTC法、BTB法、红墨水法及荧光法，测定的结果是否相同? 为什么? 哪一种方法更准确？它们与种子的实际萌芽率是否一致？如若有偏差，理论