生物分析化学 4 凝胶电泳.ppt

第四讲 电泳 主要内容 基本概念 凝胶电泳 筛分 等点聚焦 2DE 印渍分析 电泳 给定介质和电场条件下带电粒子发生运动的现象；带电粒子的电泳运动能力用电泳淌度（矢量）表征 电泳淌度的符号规定： 运动运动方向与电场强度相同为正； 电泳运动方向与电场强度相反为负。 电泳技术的发展 1908, Russian scientist Pence, Electrophoresis (1903, Russian, Tswett, Chromatography) 1937, Sweden scientist Tiselius, first practical use of electrophoresis, 5 species were separated from HAS; and won Nobel Prize in 1948, moving boundry electrophoresis （移动界面电泳） 1959, Raymond and Weintraub, slab gel electrophoresis （平板凝胶电泳） 1981, Jorgenson and Lukas, capillary electrophoresis 1990，Manz, Lab on a chip, chip electrophoresis 电泳技术的演化 凝胶电泳 在抗对流和离子导电的具有一定网状结构的凝胶介质中进行的电泳分离技术，主要用于带电生物大分子的分离。 凝胶电泳筛分介质 琼脂糖凝胶 制胶简单，分离度不高；加热溶解，室温下成胶 聚丙烯酰胺 需要从单体合成制备；分离度较高 引发剂、增速剂和聚合 引发剂：过硫酸胺、过硫酸钾或核黄素 增速剂：N,N,N‘,N‘-四甲基乙二胺 聚合：自由基反应（氧化、还原过程）。通常聚合过程在40-60 min内完成。在20-35 ?C时聚合，凝胶会比较透明而有弹性。 典型应用 琼脂糖凝胶电泳分离DNA 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 等电聚焦电泳分离 二维电泳蛋白分离（2DE PAGE） 琼脂糖凝胶电泳分离核酸 核酸带负电核线性分子，在电场的作用下向正极移动。由于凝胶的筛分作用按分子的大小分开，小的分子运动速度较快。分子量相同但构型不同的DNA分子也可以分离。 影响分离的主要因素有：分子量大小，凝胶浓度，电场强度，缓冲溶液等。 60℃制胶（中有荧光染料，EB）；点样孔在负极端 电压100 V以内，时间通常半小时以上 借助有色染料掌握停止进行电泳的时间； 用荧光显色和成像的方法记录分离结果 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 除了分离介质不同，原理与琼脂糖凝胶电泳相同 根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电组分在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应进行分离。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电组分在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 SDS蛋白筛分的原理 SDS （十二烷基磺酸钠）断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构；强还原剂使半胱氨酸之间的二硫键断裂，从而使蛋白变性。 变性蛋白质与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，分子络合物在凝胶中的迁移速度取决于分子大小。 分子量在15-200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=k-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。 将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 凝胶浓度与分子量测定的关系 等电聚焦分离Isoelectrofocusing,IEF） 等电聚焦技术是60年代发展起来的一种蛋白质分离分析手段 根据蛋白质或其它两性分子等电点不同，在一个稳定的、连续变化的pH梯度中进行蛋白质的分离。 不同蛋白质具有不同等电点，根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的区域，成为一个窄而稳定的带，从而起到浓缩和分离作用。 等电聚焦的分辨率 等电聚焦分离的程度取决于pH梯度和电场强度。用测定两个邻近带的pI差即?(pI)来表示分辨率。 D为蛋白质的扩散系数，E为场强，dpH/dx为pH梯度，d?/dpH为蛋白质的迁移率的斜率。只有通过提高场强和使用窄pH范围来提高分辨率。 固相pH梯度等电聚焦Immoblized pH gradients（IPG） IEF 固相pH梯度等电聚焦是80年代建立起来的一种新型等电聚焦技术。利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙