第六章 荧光分析法概要1.ppt

5、荧光发射 电子由第一激发单重态S1的最低振动能级跃迁至基态S0而发射的光叫荧光。 　 6、磷光发射 电子由第一激发三重态T1的最低振动能级跃迁至基态S0而发射的光叫磷光。 三、荧光强度与浓度的关系 （一）荧光效率： （二）荧光强度与浓度的关系 当激发光的强度与吸收池的厚度不变时， 由 朗伯-比尔定律推出： F=Kc 即荧光强度与荧光物质的浓度成正比 ——定量依据 跃迁类型： π→π*产生荧光的主要跃迁类型，含有π→π*共轭体系的有机分子是荧光分析的主要对象。 四、影响荧光强度的因素 1、分子结构 共轭效应： 具有共轭效应的芳香族化合物易产生荧光，凡是能提高π电子共轭程度的结构，都会增大荧光强度，并使荧光光谱长移。 苯 萘 蒽 刚性结构和共平面效应 可增强共轭程度，降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。 取代基效应：苯环上有给电子基会增强荧光而吸电子基会减弱荧光。 化合物 相对荧光强度 荧光波长/nm C6H6（苯） 10 270~310 C6H5CH3 C6H5OH C6H5OCH3 C6H5NH2 17 18 20 20 270~320 285~365 285~345 310~405 C6H5Cl C6H5Br C6H5I C6H5COOH C6H5NO2 7 5 0 3 0 275~345 290~380 310~390 2、环境因素 (1)温度 温度↓→荧光↑ (2)溶剂 极性↑→ 荧光↑；粘度↑→ 荧光↑ (3)溶液pH值 影响荧光物质存在形式， (4)荧光熄灭剂（卤素离子、重金属离子、氧分子、 硝基化合物及重氮化合物等等） 3、荧光物质浓度 在低浓度（一般≤10-6g）时，荧光强度与浓度呈正比关系——荧光法的定量依据。 自熄灭：当荧光物质高到一定浓度时，荧光分子间碰撞增多，使荧光强度减弱的现象。 思考：影响荧光强度的因素有哪些？ 影响荧光强度的因素 影响荧光强度的因素 分子结构 环境因素 刚性结构和平面效应 电子跃迁类型 共轭效应 取代基 温度 溶剂 pH 荧光猝灭剂 浓度 五、 激发光谱、荧光光谱 1、激发光谱：固定荧光发射波长，连续改变激发光波长，测定荧光强度（F）。 以F为纵坐标，激发光波长λ为横坐标作图。 最大激发波长——λex为分析用的激发光波长。 F ? 2、发射（荧光）光谱：固定最大激发光波长，测定不同发射波长的荧光强度(F)。 以F为纵坐标，荧光波长λ为横坐标作图。 选择最大荧光波长——λem作为荧光测定波长。 F ? 200 250 300 350 400 450 500 nm 激发光谱 荧光光谱 蒽的激发光谱和荧光光谱 荧 光 强 度 激发光波长 荧光波长 (1)激发光谱与吸收光谱的形状极为相似。 3.吸收光谱、激发光谱与荧光光谱的关系 F ? 激发光谱 （2）镜像规则 通常荧光光谱与激发光谱（吸收光谱）大致呈镜像对称。 S0 4 3 2 1 S1 4 3 2 1 （3）Stokes位移 Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长差值。荧光的波长总是大于激发光的波长。 200 250 300 350 400 450 500 nm 激发光谱 荧光光谱 蒽的激发光谱和荧光光谱 荧 光 强 度 （4）荧光光谱的形状与激发光波长无关 不同激发光波长只对荧光强度有影响。 l 2 l 1 l 3 l ?2 S1 T1 系间跨越 内转换 振动弛豫 S2 S0 能 量 T2 内转换 发 射 荧 光 发 射 磷 光 外转换 振动弛豫 　主要由五个部分组成：激发光源、样品池、单色器、检测器、记录仪。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 第二节 荧光光度计 一、激发光源 常用：高压汞灯，氙灯，卤钨灯 二、单色