第十一章 SILAC定量蛋白质组学技术简介.ppt

SILAC定量蛋白质组学 SILAC定量蛋白质组学 1：SILAC定量蛋白质组学原理 2: 应用 2.1：SILAC定量蛋白质组学 2.2: SILAC研究蛋白质相互作用 2.3：SILAC研究蛋白质与DNA相互作用 2.4：SILAC研究蛋白质与RNA相互作用 1：SILAC定量蛋白质组学原理 1.1：SILAC定量蛋白质组学的原理 1.2：SILAC技术流程 1.2.1：培养基准备 1.2.2：细胞标记与测试 1.2.3: 实验处理 1.2.3：蛋白质分离与质谱分析 1.2.4：结果形式 1.1：SILAC定量蛋白质组学原理 1.1：SILAC定量蛋白质组学原理 1.2.1：培养基准备 材料： （1）：Lys或（和）Arg缺陷型1640培养基， Lys或（和）Arg缺陷型DMEM培养基。 （2）：透析FBS。 （3）：稳定同位素标记的Lys和Arg。L-Lysine(13C6), L-Lysine (13C6,15N2), L-Lysine(13C6,15N2), L-Lysine(15N2,D9), L-Lysine(4,4,5,5-D4) ,L-Arginine(13C6), L-Arginine (13C6, 15N4), L-Arginine(13C6,15N4)。 培养基制备： 取相应量的稳定同位素氨基酸Lys和Arg各50mg,添加到500ml培养基中，同时添加血清（一般是10%）和抗生素后，0.22um滤膜过滤，4度保存备用。根据实验的需要，可以配制“中”型和“重”型培养基。 1.2.2：细胞标记与测试 标记： 一般细胞经过添加同位素的培养基传代培养5-6代后，一天或2天传代一次，细胞中蛋白质的Lys和Arg将被同位素氨基酸取代。添加了稳定同位素（“中”或“重”型）的细胞与“轻”型细胞相比细胞生长速度可能偏慢，这是由于透析血清与中缺乏一些盐成分，可以让透析血清在PBS里面透析，透析膜的孔径一般为10KDa. 标记测试： 在进行正式实验之前，需要对细胞进行标记测试，测试细胞中蛋白质的Lys和（或）Arg是否被相应的同位素氨基酸取代。收取 蛋白质后，等量混合，SDS分离，LC-MS/MS检测。 1.2.2：细胞标记与测试 1.2.3: 实验处理 当标记测试检测到蛋白质已被同位素氨基酸标记后，可以进行细胞处理，如药物处理，病毒处理等。 1.2.3：蛋白质分离与质谱分析 （1）：提取“轻”型”，“中”型，“重”型细胞蛋白质，等量混合，SDS分离，染色。 （2）：割取蛋白质条带，胰蛋白酶酶切。 （3）：LC-MS/MS（仪器：LTQ Orbitrap XL?)分析，数据检索。 1.2.4：结果形式 2: SILAC应用 2.1：SILAC定量蛋白质组学实例 2.2: SILAC研究蛋白质相互作用 2.3：SILAC研究蛋白质与DNA相互作用 2.4：SILAC研究蛋白质与RNA相互作用 2.1 Schematic for SILAC 2.1 MS spectra showing the four major patterns of phosphorylation observed 2.1 Quanti?cation of phosphorylation by SILAC 2.1 Conclusion 2.2 SILAC研究蛋白质与蛋白质相互作用 2.3 SILAC研究蛋白质与DNA相互作用 2.4 SILAC研究蛋白质与RNA相互作用 * * * 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 SILAC法。 1、标记：在缺乏Lys和Arg的培养基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C6 15N4)、Arg(13C6,或13C6 15N4)等培养细胞，使蛋白质被标记成“中型”或“重型”； 2、细胞处理，如药物处理； 3、细胞裂解、提取蛋白质； 4、等量混合对照与处理组蛋白质、SDS电泳、染色； 5、割取蛋白质条带，胰蛋白酶消化，质谱分析。 技术优势——目前比较蛋白质组学最先进方法 （1）高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%； （2）定量精确：线性范围广，降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； （3）高通量、灵敏度高：