反义rna 技术（antisense rna).ppt

反义 RNA 技术（Antisense RNA) 反义 RNA 技术（Antisense RNA) 反义RNA 概述 反义 RNA 技术关键 体内、体外筛选高效反义 RNA 反义RNA的应用 小结 反义RNA概述 反义RNA概念 反义RNA与反义ODN的比较 反义RNA的机制 Antisense RNA 与 Sense RNA的结合 反义RNA概念 反义RNA指的是细胞内从载体上转录的与靶RNA互补的RNA，从而抑制目的基因的表达。 反义RNA与反义ODN的比较 反义ODN的优点： 系人工合成，易获得 易标准化 易修饰 易控制 反义RNA的优点 是从载体上转录而来，在细胞内存在的时间久 可以使用不同的启动子而使它的表达具有细胞专一性 成本低 反义RNA的机制 使靶基因转录减弱 影响剪切 影响翻译 促进靶RNA的降解 Antisense RNA与Sense RNA的结合 一步反应机制（a one-step mechanism) 两步结合机制（a two-step binding mechanism) 一步反应机制（a one-step mechanism) 二聚体的形成是从两条链识别的部位开始进行的。例如：RNA-IN/RNA-OUT 两步结合机制（a two-step binding mechanism) 两条链形成二聚体的部位与其开始识别的部位是分开的。代表有：质粒R1中的CopA/CopT,质粒ColE1中的RNAI/RNAII 一步反应机制举例 反义链的5’leader序列对于结合是重要的，通过突变分析发现loop区域对于结合并不重要 两步结合机制举例 反义链和靶RNA的loop区域对于二聚体的形成是重要的 二：反义RNA技术关键 Antisense RNA 对应靶RNA的位置 Antisense RNA 与靶RNA的结构 Antisense RNA 的长度 Antisense RNA 对应靶RNA的位置(Nucleic Acids Research,2000,Vol 28,1340-1347) Antisense RNA与靶RNA的结构 自然发生的反义RNA表现出高度的二级结构，通常有一到几个茎区，茎区顶部有6--7个不配对碱基组成的环，这样的结构也出现在靶RNA中 反义RNA的二级结构也影响它们之间的结合 Antisense RNA 的长度 自然发生的Antisense RNA 的长度 文献普遍认可的长度 文献报道的其它长度 针对HIV的Antisense RNA 的长度 一种有争议的观点－ Antisense RNA 越长越有效 自然发生的Antisense RNA 的长度 一般长25nt ( Science Vol 286,950-952,1999) 普遍认可的长度 一般是70-110nt 文献报道的其它长度 645nt（AR6） 69nt 150nt 全长基因（E6/E7） 近200nt（3个ribozyme） 针对HIV的Antisense RNA 的长度 一种有新观点－ Antisense RNA 越长越有效 George Sczaliel 提出的观点，建立在数学模型和实验的基础上，我认为不完善。 (J. Mol.Bio. 294,1127-1134, 1999) 假设的根据 温度在Tm和Tm-30 oC时，结合常数K和最短链长度的平方根成正比 温度低于Tm-30 oC时，K和10?L(?=0.0017)成正比 实验步骤 首先体外转录靶RNA和反义RNA，在5’端用同位素标记反义RNA 通过3’碱水解产生连续缺失，把反义RNA e和靶RNA在37 ?c和一定的缓冲液存在的条件下退火， 不同时间取出部分产物电泳，切割双链部分，再进行变性胶电泳，筛选与靶RNA高效结合的反义RNA 。 图示 实验结果 体外筛选针对HBV的反义RNA Antisense RNA小结 结构更加重要 含有这一结构的Antisense RNA并不是都有效 但是Antisense RNA越长，含有的有效结构越多，尽管某些二级结构会改变。 仍然有必要进行筛选 体内、体外筛选高效反义 RNA 体外筛选高效反义 RNA 体内筛选高效反义 RNA 体外筛选高效反义 RNA 方法如前面所述 体内筛选高效反义 RNA Kazunarl Taira 描述了一种方法，构建了两个质粒。把一个靶基因的ORF区融合到luciferase的前面。另一个质粒为由可诱导性启动子调控的tRNA包埋Ribozyme,共转染Tet-Hela 细胞，检测luciferase 的活性来筛选高效Ribozyme，可以用同样的方法筛选高效反义 RNA MaRX方法 MaRX: An Approach to Genetics i