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Shandong University add your subheading 基于酶联技术的分子检测 主讲人：孙洁 * * * HIV试纸检测 血液检测步骤 * HIV试纸检测 快速检测试验：可采集全血或毛细血管的血液，一般15-30分钟可出结果。但假阳性及假阴性率均较高，不作为常规检测 HIV抗体初筛实验---ELISA * Contents 1 酶联免疫法--ELISA 2 基本原理 3 用于标记的酶 4 抗体的酶标记方法及标记效果测定 5 ELISA方法的步骤及基本类型 * 酶联免疫法 简称ELISA，其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 (?聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。 自从Engvall和Perlman（1971）首次报道建立酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA）以来，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。 基本原理 * 酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。  基本原理 * * 用于标记的酶 高度的活性和敏感性 在室温下稳定 反应产物易于显现 能商品化生产 用于标记 的酶需具有 的特性 * 用于标记的酶 目前应用较多的有： 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶 葡萄糖氧化酶 Horseradish peroxidase（HRP） * HRP同工酶C二级结构 308个aa组成的肽链 含有血红素，能利用H2O2氧化许多有机物和无机物 N端：固定的吡咯烷酮羧基 C端：经常丢失的丝氨酸 4个由两分子半胱氨酸组成的二硫键 HRP同工酶C三级结构 α螺旋 Β折叠 标记方法 郭春祥改良 HRP标记抗体的改良过碘酸纳法 简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备 酶与抗体交联，常用： 戊二醛法 过碘酸盐氧化法。 * * 具体操作： 将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠（NaIO4）水溶液0.5ml，混匀置4℃冰箱30分钟 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30分钟后加入含5g纯化抗体的水溶液1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时（或过夜）使之结合，然后吸出，加硼氢化钠（NaBH4）溶液（ 5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中，并对之透析过夜（4℃），次日离心除去不溶物，即得到酶标抗体，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。 标记方法 * 酶标抗体标记效果测定 （1）酶与抗体的活性 常用琼脂扩散或免疫电泳法，使抗原与抗体形成沉淀线，经PBS漂洗1天，再以蒸馏水浸泡1小时，将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色，如果出现应有的颜色反应，再用生理盐水浸泡，颜色仍然不褪，表示结合物既有酶的活性，也有抗体活性。 （2）结合物的定量测定 　一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。常用紫外分光光度计于403nm和280nm进行测定。 酶结合率为 7％时效果一般，为9％－10％较好，达30％以上时最好。 * * ELISA方法的步骤及基本类型 step4 step3 step2 step1 血液凝集取血清 稀释酶复合物加血清、 阴阳性对照 、质控品 孵育一小时 洗板 加底物 避光反应半小时 加终止液 读数 判断阴性或阳性 ELISA的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。 ELISA方法的步骤 * ELISA方法的步骤 * * ELISA具体方法： （2）双位点一步法 （4）竞争法 （6）应用亲和素和生物素 （1）双抗体夹心法 （3）间接法测抗体 （5）捕获法测lgM抗体 竞争法 * 竞