PEG10基因siRNA真核表达载体的构建及其对.docVIP

　　PEG10基因siRNA真核表达载体的构建及其对 【关键词】 PEG10基因；RNA干扰；表达载体 　　【Abstract】 AIM: To construct the siRNA eukaryotic expression vectors of PEG10 gene and to investigate their apoptosisinducing effect on transfected HepG2 cells in vitro. METHODS: Three specific siRNAs of PEG10 ine 2000. Realtime quantitative PCR easure the PEG10 mRNA expression in HepG2. The cell groetry and confocal microscopy. RESULTS: Three specific siRNA eukaryotic expression vectors (siRNA1, siRNA2, siRNA3) targeting PEG10 RNA to varying degrees. The expression of PEG10 mRNA arkably inhibited at 48 h after transfection, and siRNA2 resulted in the highest inhibition rate (93.99%). HepG2 groega公司）；optiMEM和转染试剂Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）；高纯质粒提取试剂盒（杭州Vgene公司）；DNA凝胶回收试剂盒（上海华舜生物工程公司）；人Annexin VFITC试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司）. FACSort流式细胞仪（Bacton Dickinson公司）；FV500共聚焦显微镜（Olympus公司）；Multiskan Mk3酶标仪（Thermo Labsystems公司）. 　　1.2方法 　　1.2.1siRNA靶序列的设计利用GenBank检索PEG10 mRNA（录入号：AB049834）全长序列，遵循siRNA的设计原则，通过Invivogen公司提供的siRNA ine2000说明书进行. 根据是否进行质粒转染和转染质粒的不同分为6组. 即空白对照组(不进行转染的同期培养的HepG2细胞),空质粒组(转染psiRNAhH1neo空质粒),siRNA1组、siRNA2组和siRNA3组(分别转染3个重组质粒siRNA1，siRNA2和siRNA3),非特异性siRNA组(转染重组的非特异性siRNA质粒). 　　1．2．4实时定量PCR检测PEG10表达将重组质粒和空质粒分别转染HepG2细胞并培养48 h后用Trizol试剂提取各组1×107细胞总RNA，逆转录成cDNA第1链，然后以cDNA为模板，分别对PEG10基因及βactin进行Realtime PCR反应，反应体系为：cDNA 1 μL，20 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，dNTP混合液3 μL，Taq DNA聚合酶3 U，MgCl2溶液3 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，SYBR Green I 6.25 μL，去离子水补至25 μL. PCR扩增条件94℃变性5 min，35个PCR循环（94℃ 20 s；58℃ 20 s；72℃ 20 s），72℃延伸5 min，75℃时检测荧光信号，绘制标准曲线. 引物序列：PEG10，上游: 5′ CCAAGTCGCTGTCTGCTCTGA 3′，下游: 5′ GCGTAGTGACCTCCTGTTCCA 3′；βactin，上游: 5′ CCTGTACGCCAACACAGTGC 3′，下游: 5′ ATACTCCTGCTTGCTGATCC 3′. 根据绘制的标准曲线得到PEG10基因及βactin表达的相对浓度，以PEG10基因与βactin相对浓度的比值来反映PEG10表达量. 每个样品做2个平行管，实验重复3次. 使用RotorGene 6.0分析软件对实验结果进行分析. PEG10表达抑制率(%)=（1-转染组PEG10表达量/对照组PEG10表达量）×100％. 　　1.2.5MTT法检测细胞增殖取对数生长期HepG2细胞，转染前1日以1×104/孔接种96孔板，将重组质粒和空质粒分别转染细胞中，继续培养24，48，72，96，120 h后分别加入5 g/L MTT 20 μL，37℃避光孵育4 h，弃去培养基，加入100 μL DMSO，避光30 min，待其完全溶解后，用酶标仪测定A490 nm值. 以空质粒转染组作为