胸膜肺炎放线杆菌血清1型ApxIAN端多肽免疫原性的确定及表达该多肽汇编.ppt

猪传染性胸膜肺炎（PCP）是危害全球养猪业的重大传染病，由于APP有15个血清型，防治困难。 血清型10外所有血清型菌都能分泌ApxⅡ蛋白，它也是一种重要的保护性抗原。因此，apxⅡ基因是研究PCP新型疫苗的良好目标基因。 ( Bei etal, 2005 FEMS Microbiology letter) ApxI A全长基因的克隆 ApxIA N端免疫原性的预测 rApxIA N端蛋白的克隆及表达 动物试验 讨论 技术路线简图 4. 讨论 1. 克隆了ApxIA的全长基因序列，预测了apxI 5端编码的380个氨基酸的免疫原性指标 2. 原核表达两种蛋白并用western-blot证实表达蛋白的生物学活性 3. 动物实验证实N端多肽具有良好的免疫原性 4. 构建三对重组载体，为毒力调节蛋白ApxIIC的激活功能域的研究和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌无抗性标记重组疫苗菌株的构建奠定基础 5. 重组转化子的筛选过程中，我们发现了蔗糖的自发抗性和卡那霉素的自发抗性。初步探讨了两种抗性产生的原因，筛选出新的抗性标记氯霉素抗性标记。并对重组系统做出了几个方向的改进，为今后高效筛选重组转化子提供了借鉴。 硕士期间发表论文 致 谢 比较AHC40嵌合毒素与绵阳血红细胞以及HL-60细胞之间的相互作用 1.自发抗性现象的发现及原因分析 不同卡那霉素浓度筛选重组转化子的影响 ND ND ND √ √ √ 反向质粒划线接种 ND ND ND √ √ √ 正向质粒划线接种 × × × × √ √ App-7电转感受态接种 × × × × × × App-7感受态接种 × × × × × × App-7复苏菌液接种 × × × × × × App-7划线接种 50 45 40 35 30 25 不同卡那霉素浓度对筛选重组转化子的影响（μg/ml） 电转化项目 讨论 未筛选到突变株的原因 APP 7型不存在限制性作用 Tason（1995）等人在同一个试验中用于突变apxICA和apxIICA，后者转化效率低20-30倍。 王春来（2003）利用非复制性打靶载体突变apxIICA后没有筛选到突变株。 2. apxIICA 自身的基因组特点 讨论 未筛选到突变株的原因 nptII-SacB表达盒在大肠杆菌中经过了功能验证 nptII-SacB表达盒中nptII基因来源于转座子Tn5 尽管转座子Tn5、Tn10常应用于革兰氏阴性菌的突变体库的建立，但未见有Tn5应用于胸膜肺炎的报道。 3. nptII-SacB在胸膜肺炎放线杆菌中的表达 讨论 试验改进的方向 1.表型筛选标记 正常工作浓度下不同抗性筛选标记对细菌转化的影响 × √ √ × √ √ App-7电转感受态接种 × √ √ × √ √ App-7感受态接种 × √ √ × √ √ App-7复苏菌液接种 × √ √ × √ √ App-7划线接种 HMr GTr Strepr Cmr tetr Kamr 不同抗生素筛选标记对细菌转化的影响 电转化项目 讨论 试验改进的方向 1.表型筛选标记 增加新的高通量表型筛选标记 ：目标基因所表现出来的表型特征 胸膜肺炎放线杆菌血清7型溶血现象。 其他的表型筛选标记：lacZα xylE sacB-5FOA-pyrE 可以替代抗性标记 讨论 试验改进的方向 2.更换成接合转移系统或者噬菌体介导的转导系统 转化方式的改变也许能够避免自发抗性现象的发生 在已知的研究报道中，质粒接合转移的转化效率很高 噬菌体介导的转导系统可以对40-110Kb的大片段进行突变 讨论 试验改进的方向 3.采用可控型复制性质粒 自杀性质粒载体的短暂时效，与染色体同源重组几率很小。 构建APP-E.coli穿梭载体，穿梭载体可以增加转化子中质粒的拷贝数，从而增加重组效率 讨论 四、 小结与展望 小结与展望 小结与展望 1. 梅岭，卢海松，贝为成，周锐*，洪文洲，陈焕春．猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型RTX毒素I的N-端多肽具有良好的免疫原性 生物工程学报 2006, 22(1), 35-41. 2. 梅岭，卢海松，贝为成，周锐*，洪文洲，陈焕春．表达ApxIA的重组胸膜肺炎放线杆菌血清7型候选疫苗菌株重组载体的构建 农业生物技术学报 审稿中 3. Mei Ling, Lu Hai-Song, Bei Wei-Cheng, Zhou Rui*, Hong Wen-Zhou, Chen Huan-Chun Study on Immunogenicity of the N-terminal Polypeptide of RTX Toxin I of Actinobacillus Pleuropneumoniae Chin