何首乌基因组DNA提取及RAPD反应体系正交设计.docVIP

　　何首乌基因组DNA提取及RAPD反应体系正交设计 【摘要】 　　目的确定适合何首乌RAPD-PCR的基因组DNA提取方法及最适宜反应体系。方法通过改良的CTAB法提取何首乌基因组DNA，研究其用于RAPD-PCR的可行性。利用正交设计方法L16 (45)，针对Tag酶，引物，dNTP，镁离子，模板设计了5因素4水平的正交实验，优化RAPD-PCR反应体系。结果正交设计结果表明，可以得到几种不同的有效扩增反应体系组合。根据实际需求，最适宜的RAPD-PCR反应体系为20 μl，其中1×PCR buffer, Tag酶 1U，引物 1 μmol/L，镁离子 2 mmol/L，dNTP 300 μmol/L，模板 40 ng。结论改良的CTAB法和正交优化得到的反应体系适合用于何首乌RAPD遗传多样性分析。 【关键词】 何首乌； DNA提取； RAPD； 正交设计 　　何首乌是我国传统医药中的名贵药材，何首乌块根及茎叶均可入药。何首乌具有补肝肾、益精血、乌须黑发、养心安神等功效，主治血虚身痛、心烦失眠、劳伤多汗等症。同时可用于保健和食品等多方面，何首乌块根富含淀粉，含量高达45.2%，药食两用。 　　RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)技术是由美国学者AN DU 530型分光光度计（BECKMAN公司），BIO-RAD凝胶成像系统（BIO-RAD公司），BECKMAN Microfuge 22R冷冻离心机（BECKMAN公司），稳压稳流电泳仪（BIO-RAD公司） 　　Tag酶，dNTP,Mg2+,10×PCR buffer，λ-EcoT14Ⅰdigest，DL2000均购自TaKaRa公司，随机引物(invitrogen)，DNA Marker Ⅲ(天根公司)，CTAB(Amresco)，PVP(Sigma)，β-巯基乙醇(Sigma)，RNase A(Sigma)，琼脂糖(Biol eppendorf管中；加入700 μl CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）抽提缓冲液65℃保温45～60 min，期间轻缓颠倒摇动数次，取出eppendorf管，使之恢复室温；加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)抽提，轻缓颠倒混匀，室温下8 000 r/min离心20 min； 吸取上清液,加入100 μl体积的10% CTAB溶液(10%CTAB, 0.7 mol/L NaCl)，再加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)，重复抽提1次，轻缓颠倒混匀,室温下8 000 r/min离心20 min；吸取上清,加入200 μl体积的NaAc和等体积预冷异丙醇，混匀，-20℃下放置30 min以上, 8 000 r/min离心20 min，去上清后分别用70%乙醇和90%乙醇各洗涤1次, 室温吹干后溶于50 μl，无菌双蒸水中,用RNase A于37℃处理1 h去除RNA，分装后放入- 20℃储存或放入4℃待用。 　　DNA样品用无菌双蒸水溶解并稀释后,于260，280 nm 处用分光光度计进行浓度测定。通过260 nm处的吸光值A260计算浓度，浓度(ng/μl)=50 ng/μl×A260×稀释倍数。并用0.6%琼脂糖凝胶，电压95 V，在1×TAE电泳缓冲液中电泳30 min检测DNA模板质量，最后对所提的DNA做一个RAPD预扩增，采用的反应体系和扩增程序参照高永利等［5］的方法。 　　2.2 RAPD- PCR反应体系的正交设计方案选择Tag DNA聚合酶，引物，Mg2+，dNTP，模板5个主要影响影响RAPD-PCR反应的因素进行正交实验设计，每个因素选择4个浓度水平，设计因素水平表。见表1。由于RAPD-PCR反应体系较复杂，RAPD-PCR电泳图谱主要以直观判别，故不考虑各因素之间的交互作用。根据正交设计实验表L16(45)安排实验方案。见表2。表1 正交实验设计因素水平表，表2 L16(45)正交实验计划表（略） 　 　　2.3 RAPD- PCR实验正交优化根据表2的方案，每个实验都采用的是20 μl反应体系，依据正交计划表次加入各反应成分，用灭菌双蒸水补充总体积至20 μl。在PCR仪上扩增，热循环参数为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，37℃退火1 min，72℃延伸2 min，如此进行40个循环，最后72℃延伸7 min［6］ 。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳检测，电压为90 V，1×TAE电泳缓冲液中电泳25min，电泳结束后置于凝胶成像系统中观察并拍照。 　　3 结果 　　3.1 基因组DNA浓度及质量检测改良后的CTAB法提取的DNA呈白色半透明状，溶于水。用灭菌双蒸水稀释100倍后测定A260和A280处的吸光值，计算后得到的结果见表3。表3 基因组DN