pET原核表达系统简介28.pptVIP

PET原核表达系统简介;目录; PET系统是有史以来在 E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。目的基因被克隆到 PET质粒载体上，受噬菌体 T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。;选择PET载体：;PET系统的优点：;PET系统操作流程：;PET系统的组成：;制备插入DNA：;将插入片段克隆到PET载体上：;转化表达宿主菌;A. 转化表达菌株 为了转化入表达用宿主菌株（如DE3 溶原菌），先要准备合适的感受态细胞，选用经无菌水或TE缓冲液稀释50倍的质粒1μl（约1ng），按公司的操作流程转化步骤进行操作，单个克隆划线转化和甘油保存。 B. DE3 溶原菌的诱导 若目标质粒已存在于 DE3 溶原菌中，在生长培养基中加入IPTG 即可诱导目的DNA的表达。对于带普通T7 启动子的PET 重组子，终浓度为0.4mM 的IPTG 可以实现完全诱导，而带有T7lac启动子的载体则需要终浓度为1mM 的IPTG 才能完全诱导。诱导的具体操作见公司操作流程。在一些 DE3宿主菌中通过调节IPTG的浓度可以改变蛋白表达的水平。RosettaTM(DE3)，TunerTM(DE3)和OrigamiTM B (DE3)菌株都包含了lacY1 突变，它们都消除了乳糖通过lac 透性酶进入细胞的主动运输。因此这些菌株对于培养基中的乳糖不敏感，IPTG 对所有细胞的诱导更为均衡。当采用这些菌株时，IPTG 的浓度应在25μM-1mM 之间选择，确定最佳IPTG浓度使目的蛋白达到最佳的活性和溶解性。 ;优化表达条件：; 在 E.coli中表达的重组蛋白经常以聚集的形式表达，被称作包涵体。即使在形成包涵体时，还是有一部分目的蛋白是溶解的。由于PET 系统的高表达水平，即使有大量的目的蛋白聚集形成包涵体，也会有相当多的可溶性目的蛋白存在。在通常情况下，降低蛋白合成速率，如降低诱导培温度及在基本培养基中生长都会使目的蛋白的可溶性增加。在许多应用中需要目的蛋白以可溶及活性形式存在。; 多数氨基酸都有一个以上的密码子，对E.coli密码子应用情况的分析表明一些密码子很少使用。??其是Arg密码子AGA,AGG,CGG,CGA,Ile密码子AUA,Leu密码子CUA,Gly密码子GGA和Pro密码子CCC很少被用到。当异源目的基因的mRNA在E.coli中过表达时，tRNA的数量直接反映了mRNA的密码子偏倚性。由于一个或多个tRNA的稀有或缺少可能导致翻译的停止。不充足的tRNA库可能导致翻译延迟、成熟前翻译终止、翻译移码和氨基酸错配。RosettaTM菌株被用来增加含有稀有Arg密码子AGG和AGA，Ile密码子AUA，Leu密码子CUA,Pro密码子CCC和Gly密码子GGA目的蛋白的表达。tRNA由一个与pET载体相容的氯霉素抗性质粒(以pACYC为骨架)带有的自身启动子所表达。含有pLysS的Rosetta菌株在带有T7溶菌酶相同骨架上带有编码稀有密码子的基因。Rosetta菌株是lon和ompT蛋白酶缺陷型的一个B-衍生菌。RosettaBlueTM和Rosetta-gamiTM菌株分别衍生于K-12 NovaBlue菌株和Origami菌株。RosettaBlue还具有高转化效率，以及由高水平lac阻遏子(lacIq)所带来的严紧性控制。Rosetta-gamiTM菌株是trxB/gor突变株，通过形成二硫键促进蛋白折叠（二硫键形成及可溶性增强）。Rosetta菌株相当适合用于表达那些含有E.coli稀有密码子基因的目的蛋白。;PBR322质粒及其衍生型（包括PET载体）在宿主菌中相当稳定，即使在没有抗生素压力的情况下培养数代，大部分宿主菌中仍保有这些质粒。如果克隆入质粒的外源基因产物对宿主菌具有毒性，就会遇到质粒不稳定的问题。PETcocoTM系统通过降低PETcoco的拷贝数直至每个细胞中仅一个拷贝来降低基础表达水平（Sektas and Szybalski,2002）。毒性极大的基因产物也可以在该系统中稳定存在并表达。在PET系统中，可在菌株生长已受损害的情况下维持质粒的存在和一定表达水平；缺乏质粒的细胞可能由于质粒拷贝数的降低或其他原因，其数量有所增加。在这种情况下，若没有选择压力，不含质粒的细胞将很快生长。如果要使大部分细胞都含有质粒，培养基中一定不能没有抗生素。;目的蛋白的纯化