A～D基因型乙型肝炎病毒全长逆转录酶区PCR方法的建立及应用.pdfVIP

肝脏 2008年 10月第 13卷第 5期 · 论 著 · A～D基因型乙型肝炎病毒全长逆转录酶区 PCR方法的建立及应用 刘宝明 李彤 董建平 胥婕 李晓光 严平 王风水 闫玲 李文鹏 金晖 杨靖娴 庄辉 【摘要】 目的 建立适用于扩增我 国常见的乙型肝炎病毒 (HBV)A～D基 因型全长逆转录酶 (RI’)区(包含全长 HBsAg编码 区)的聚合酶链反应(PCR)法 ，并确定其在分析临床标本 中的应用价值 。方法 建立我 国HBV基因序列 库 ，设计适用于扩增 A～D基 因型 HBV全长 RT 区引物 ，以 A～D基 因型 HBV重组质粒为模板建立半巢式 PCR (snPCR)法 ，并确定该法灵敏度 。用所建立的 snPCR对 44份 HBVDNA定量 阳性 (5．0x101拷贝／m1)慢性 乙型肝炎 患者血清标本进行扩增及 PCR产物直接测序 。结果 琼脂糖凝胶 电泳及测序证实，snPCR可扩增 A～D基 因型 HBV 全长 RT区，对 A、B、C和 D基 因型 HBV质粒扩增 的灵敏度分别为 1．2×10’、7．(1×101、6．(1×10和 6．0×10拷贝／ml。 snPCR检测 HBVDNA5×10拷贝／ml血清标本的阳性率为 88．64 (39／44)，扩增 阴性血清标本 HBVDNA滴度 均处于 10拷贝／ml水平 。扩增 目的产物经直接测序确证无误 。生物信息学分析显示 ，样 品中B和 c基 因型分别 占 35．9() (14／39)和 64．10 (25／39)；其 中 15．38 (6／39)发生 RT 区变异，包括 4例为已知耐药变异 ；7例(17．95 )存 在 HBsAg编码区变异，其中2例为 已知免疫逃逸变异 ；6例 (15．38 )发生 RT区和 HBsAg编码 区 “镜像改变”。结论 建立 了一种新 的扩增全长 RT区 (涵盖全长 HBsAg编码区)的 snPCR。该法结合直接测序法 ，可 同时分析我 国 HBV A～D基 因型已知和潜在的耐药变异位点 。 【关键词】 乙型肝炎病毒 ；逆转录酶区；基 因型；耐药变异 ；免疫逃逸变异 Establishmentand application ofanovelPCR assayforamplifyingthefull-length reversetranscriptasegeneregion ofgeno’- typesA～D ofhepatitisBvirus 1IU BaominK，IlTong，DON(；Jian—ping，xU j ，LIXiaoguang，YAN Ping，WANGFengshui，YAN Ling，LIWen—peng，JINGHui，YANGJing一,Tian，ZHUANGHui． Departmento／ M robiology，PekingUniversityHealthS( ”(eCenter，Beijing100191，()hina [Abstract] Objective Toestablishapolymerasechainreaction(PCR)assayforamplifyingthefull—lengthreverse transcriptase(RT)region (full—lengthHBsAgcodingregion included)ofgenotypesA～ D ofhepatitisB virus(HBV)， andtoestimateitsapplicationforanalyzing clinicalsamples．Methods Threeprimersforsenti—nestedPCR (snPCR) weredesignedforamplifyingRT regionofHBV genotypesA～ D basedonHBV sequencedatabase．FourHBV recombi nantplasm idscontainingA～ D genotypesfulll