酵母RNA的提制(浓盐法)_百替生物.pdfVIP

实验三 酵母RNA 的提制（浓盐法） 一、目的 学习和掌握从酵母中提制RNA 的原理和方法，以加深对核酸性质的认识。 二、原理 酵母含 RNA 2.67 ％～10.0％，DNA 很少（0.03 ％～0.516 ％），而且菌体容易收集，RNA 也易于 分离，所以选用酵母为实验材料。 RNA 提制过程是先使RNA 从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。再根据核酸 在等电点时溶解度最小的性质，将pH 调至2.0～2.5 ，使RNA 沉淀，进行离心收集。 提取 RNA 的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。前者利用稀碱溶解细胞壁，使 RNA 释放出来，这种方法提取时间短，但RNA 在此条件下不稳定，容易分解；后者在加热的条件下， 利用高浓度的盐改变细胞膜的透性，使RNA 释放出来，此法易掌握，产品颜色较好。 三、仪器、试剂和材料 1．仪器 （1）量筒（50ml ） （2 ）三角瓶（100ml） （3 ）烧杯（250ml ，50ml，10ml） （4 ）布氏漏斗（40mm ） （5 ）吸滤瓶（125ml） （6 ）表面皿（6cm ） （7 ）751 型分光光度计 （8 ）离心机（4000r ／min ） （9 ）恒温水浴 （10）药物天平 （11）烘箱 2 ．试剂 （l ）NaCl （化学纯） （2 ）6mol ／L HCI （3 ）95 ％乙醇（化学纯） 3 ．材料 鲜酵母或干酵母；pHO.5～5.0 的精密试纸。 四、操作步骤 1．提取 称取鲜酵母 159 或干酵母粉 2.5g ，倒入 100ml 三角瓶中，加 NaCl 2.5g ，水25ml ，搅拌均匀， 置于沸水浴中提取lh 。 2 ．分离 将上述提取液用自来水冷却后，装入大离心管内，以4000r ／min 离心10min，使提取液与菌体残 渣等分离。 3 ．沉淀RNA 将离心得到的上清液倾于50ml 烧杯内，并置入放有冰块的250ml 烧杯中冷却．待冷至 10℃以下 service@100 时，用6mol ／L HCI 小心地调节pH 值至 2.0～2.5 （注意严格控制pH ）。调好后继续于冰水中静置 10min，使沉淀充分，颗粒变大。 4 ．洗涤和抽滤 上述悬浮液以 4000r ／min 离心 10min，得到 RNA 沉淀。将沉淀物放在 10ml 小烧杯内，用 95 ％的乙醇 5～10ml 充分搅拌洗涤，然后在布氏漏斗上用射水泵抽气过滤，再用 95 ％乙醇 5～10ml 淋洗 3 次。 5 ．干燥 从布氏漏斗上取下沉淀物，放在 6cm 表面皿上，铺成薄层，置于 80℃烘箱内干燥。将干燥后的 RNA 制品称重，存放于干燥器内。 6 ．含量测定 将干燥后RNA 产品配制成浓度为 10—50pg ／ml 的溶液，在751 型分光光度 计上测定其260nm 处的吸光度，按下式计算RNA 含量： 式中，A260 为260nm 处的吸光度；L 为比色杯光径（cm ）；0.024 为lml 溶液含l μg RNA 的吸光度。 五、结果处理 根据含量测定的结果按下式计算提取率 六、注意事项 1．用浓盐法提取RNA 时应注意掌握温度，避免在20～27 ℃之间停留时间过长，因为这是磷酸二 酯酶和磷酸单酯酶作用活跃的温度范围，会使RNA 降解而降低提取率。 2 ．加热至90～100℃使蛋白质变性，破坏两类磷酸酯酶，有利于RNA 的提取。 七、思考题 1．沉淀RNA 之前为什么要冷却上清液至10℃以下？ 2 ．为什么要将pH 调至2.0～2.5 ？ 参考文献 文树基。主编基础生物化学实验指导．西安：陕西科学技术出版社，1994 西北农业大学主编基础生物化学实验指导。西安：陕西科学技术出版社，1986