以下之寡核酸应用于定位突变法及电泳漂移分析之实验，并以下标线的.PDF

以下之寡核酸應用於定位突變法及電泳漂移分析之實驗，並以下 標線的位置代表定位突變的位置。 (1) ATAAG CAGAGCTGCTTTAGTGAACGCTCAGATCGCCTG (2) CAGGCGATCTGAGCGTTCACTAAAGCAGCTCTGCTTAT (3) GGGCGTGGATAGGCGTTTGACTCAGCGGGATTTCCAAG (4) CTTGGAAATCCCGCTGAGTCAAACGCCTATCCACGCCC (5) CCAGTGAATTCAGCTATTAGTCATGCCTATTACCATGG (6) CCATGGTAATAGGCATGACTAATAGCTGAATTCACTGG 貳、 實驗方法 一、 質體的獲得與構築 本論文用在以人類細胞表現人類巨細胞病毒全長 IE 蛋白 IE2-86 的表現質體為pS2〈由林陽生博士所提供〉。pS2 質體是由 IE2-86 的 cDNA 與質體pS424 構築而成，可在人類細胞中表現全長為579 個胺 基酸的人類巨細胞病毒 IE2-86 蛋白，IE2-86 蛋白的表現由 SV40 啟 動子所控制(Pizzorno et al., 1991; Tsai et al., 1996)。用在以特殊大腸桿 菌株 XA-90 表現人類巨細胞病毒全長 IE 蛋白 IE2-86 的表現質體為 pGST-IE2〈由吳成文博士所提供〉。pGST-IE2 是將 IE2-86 的 cDNA 18 轉殖到質體pGEX-3X 〈Amershan Phamacia Biotech Inc., Piscataway, NJ USA 〉中，可在大腸桿菌XA-90 中表現GST- IE2-86 融合蛋白， 且23 KDa 的GST 蛋白接在IE2-86 蛋白的N 端，融合蛋白的表現可 受IPTG 誘導控制。用在以另一特殊大腸桿菌株BL21 〈DE3 〉表現人 類巨細胞病毒 C 端半長的IE2-86C 的表現質體為pGST-IE2〈由林陽 生博士所提供〉。將IE2-86 蛋白的C 端，包括第290 到第579 個胺基 酸的 cDNA 轉殖到質體 8His-pET11d〈Novagen Inc., Madison ,WI USA〉中，接在八個組胺酸〈Histidine〉之後，可在大腸桿菌BL21 (DE3) 中表現含八個組胺酸於融合蛋白N 端的His-IE2-86C，與GST- IE2-86 融合蛋白類似，融合蛋白的表現可受IPTG 誘導控制。 所有表現螢火蟲螢光素酶 〈firefly luciferase〉的報導質體〈reporter plasmid〉皆依照標準步驟進行DNA 轉殖〈cloning〉反應。第一個是 質體pMIEP-Luc 經由下列步驟進行轉殖(i)利用限制酶 Nco I 及Xba I 將全長的螢火蟲螢光素酶 cDNA 自質體 pGL3-basic〈Promega Inc., Madison, WI USA〉切下且將端點補平，(ii)質體pCMV-β〈Clontech, Palo Alto, CA USA 〉以限制酶 Not I 處理，並將含第–600 序列到第+1 序列的 MIEP 的 DNA 片段以 Prep-A-gene〈Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA USA〉自電泳膠體純化出來，(iii)以 T4 DNA 連接酶 19 〈ligase〉黏接上述兩者的產物。並以下述之定位突變法生產各種 MIEP 之定位突變表現質體，將代表MIEP 上不同突變位置的表現質 體分述如下〈圖 11〉： (a) pMIEP(–240/+1)mut1-Luc ：突變的位置在第–240 序列到第+1 序 列的MIEP 片段內的–240 ，–170 及CRS 〈cis respression signal 〉 (Jupp et al., 1993a; Liu et al., 1991)區域 。 (b) pMIEP(–240/+1)mut2-Luc ：突變的位置在第–240 序列到第+1 序