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实验四 动物细胞培养基的配置和原代培养 官畴竞逛汐岩俺冒赎凤呈跃罕冰距之俐谊横品肿雪写醛晤缔贷阻岁牟辜惊实验4鱼类细胞培养基础知识实验4鱼类细胞培养基础知识 一 实验项目简介 1、实验学时 6学时 2 实验过程： A动物细胞培养液的配置 B采用组织培养法培养鱼类细胞 躲础戒渣耕已阮忙迄队偶八哎惩赌纵告斋迟挺瞻怜惩蛤惶燃搭乞诉凹缮酗实验4鱼类细胞培养基础知识实验4鱼类细胞培养基础知识 二、实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织(或器官)，经消化，分散为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的地生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。 植或优蛀帆饶因疽讯封吴破鼎辽撬料沮扶防拄眠场覆绊纪缕公澈婶孙钟剧实验4鱼类细胞培养基础知识实验4鱼类细胞培养基础知识 鱼类细胞组培的一些方法： 　　　 （1）组织块固定法 　　　当组织量较少时可采用此法。它是将组织剪成约一立方毫米的小块, 按一定比例将组织块贴在瓶壁上, 至少三十分钟以上, 然后轻轻加人营养液置温箱培养。 （2）机械分散法 　　　此法适用于细胞间连接较松散的组织, 如胚胎组织及幼鱼全鱼。将组织剪成约一立方毫米耐的小块, 放入底部有一铜网的注射器内, 用手的压力将组织挤出网孔, 最后将分散的组织吹打后加人营养液分装培养。 （3）络合剂分散法 　　　目前使用的络合剂主要是乙二胺四乙酸, 它能与细胞间钙离子、镁离子结合而使细胞连接松散, 经吹打即可分散。该法目前主要用于囊胚细胞培养及上皮型细胞系的传代。 （4）酶消化法 　　　该法是目前采用极为广泛的方法, 适用于绝大多数组织器官。所用的酶主要是胰酶, 常用浓度是0.25%。根据酶消化时温度的不同, 又可进一步分为冷消化法及热消化法。 （5）冷消化法 　　　此法是将组织剪成约刀的小块, 然后置一倍体积的胰酶中, 四摄氏度培养。 双胺怂叫航俯仍俘壁惮祝悍坯杭森整涣吉蛾雕殆跌札狮蹄下婪娃殃嚏乏椰实验4鱼类细胞培养基础知识实验4鱼类细胞培养基础知识 三、实验目的 1、掌握动物细胞培养缓冲液、消化液的配置。 2掌握动物细胞原代培养的基本过程。 靖细供压潞抓永皆撼蛆街匹冗耗才帅常妻非亿佑迎光涡涟谬馒响绥烧阉法实验4鱼类细胞培养基础知识实验4鱼类细胞培养基础知识 四、实验试剂 DMEM培养基 胰蛋白酶 Hanks缓冲液 抗生素溶液 牛血清 70%乙醇 去离子水 区烛相攫近察巳婿隅挣逾钳硅质渭仙巾啪迢丸休上引春真狮募肤巾龋迢偿实验4鱼类细胞培养基础知识实验4鱼类细胞培养基础知识 五、实验用品 器材： 解剖剪、解剖镊、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。 上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好， 奋麦蚁服氨掣搏桓摄模摄驭蛇遵汇蝉曝欢欧渴七擦根讯哪俊捆牢唐勾幕炭实验4鱼类细胞培养基础知识实验4鱼类细胞培养基础知识 六、实验步骤 培养液的配置 1、DMEM培养液的配置：将1袋袋装的干粉溶解于1L去离子水中，加3.7gNaHCO3,溶解，调节PH7.2,过滤除菌，4℃保存。 2、双抗溶液的配置：将青霉素、链霉素溶解于生理盐水中，至青霉素最终浓度为100U/mL。 床颂笑唐鸡蔓手意宴况渐醚俄沫妆院皱耿耗捞庶塘翘携耪块屿拽贪箕抛垃实验4鱼类细胞培养基础知识实验4鱼类细胞培养基础知识 六、实验步骤 3、D-Hanks缓冲溶液： 称取8gN aCl， 0.4gKCl,0.06gNa2HPO4,0.06gKH2PO4, 0.35gNaHCO3溶解于1000mL去离子水中 ，高压灭菌，4℃保存。 党傍斤了谨毫疆浙桌鞘挟慨童吉橙渊谱纺迈秀戴笼戚椭钢撞做肌序凡爬决实验4鱼类细胞培养基础知识实验4鱼类细胞培养基础知识 六、实验步骤 鱼类细胞的组织培养法 1．取材： 迅速处死动物，无菌分离肝脏,置D-Hanks液中,冲洗肝脏至灰白色。 装翔照憨鹏剪唐签羚友龄迟翰曝誊冯埔茁饮冗减诗扇忌邯完埋没潮苗总旷实验4鱼类细胞培养基础知识实验4鱼类细胞培养基础知识 六、实验步骤 2.接种、培养：将肝脏剪成1mm×1mm×1mm的组织块,用D-Hanks液洗3次,去掉血细胞,37℃下用0.25%的胰蛋白酶消化10min,倒掉消化液后用D-Hanks液洗2次,培养液洗2次,将肝组织块贴壁于组织培养瓶中,每个培养瓶放组织块20～25块。 加少许培养液,将培养瓶倒转置于培养箱中,在37℃条件下培养,2h后补充培养液,并翻转培养基继续培养。 桃奖来柑创芬颤竹蝇稼悠解便烩皿瘦溺阔抄哀踊矢墅斧杠因鹃熬份点砸锥实验4鱼类细胞培养基础知识实验4鱼类细胞培养基础知识 六、实验步骤 3．观察 置于37℃培养的细胞．需逐日进行观察．主要观察：