实验4-细菌的变异.ppt

实验四 细菌的变异，细菌的毒力测定及细菌在自然界的分布微生物学教研室黄红莹 目的要求 1. 掌握人体中细菌分布的检测技术 2. 掌握内毒素测定实验原理及实验方法。 3. 理解细菌变异的原因，观察细菌变异现象，加深对变异机制的认识。 一、细菌的分布 1、空气中的细菌检查 2、水（自来水）中细菌的检查 3、手和咽喉中细菌的检查 1. 皮肤表面细菌的检测 右手食指沾取生理盐水，轻轻涂抹培养基表面，37℃培养24h后，观察结果。 2. 人体咽腔中细菌的检测 取咽试子轻轻涂抹培养基表面，37℃培养24h后，观察结果。 3. 空气中细菌的检测 取一个培养基，打开皿盖10min，37℃培养24h后，观察结果。 自来水中细菌数量的检测 卫生学规定：生活饮用水的细菌总数，每毫升不得超过100个，1000毫升饮用水中大肠菌群数不得超过3个。 1. 实验材料：无菌平皿，生理盐水，高层琼脂，吸管 水中细菌的检测 具体步骤： 1.用灭菌的生理盐水依次稀释自来水,稀释倍数为1:5, 1:10。倍比稀释 2.取1ml移入已灭菌的空平皿，加入冷却至45~50℃高层琼脂培养基，迅速混匀后，待冷凝固。 3.倒置与培养箱培养24h。 4.观察结果。 倍比稀释 菌落计数 细菌菌落计数一般采用9厘米平皿，倾注法培养后计数选取30－300间的稀释度计数并乘以相应稀释陪数，如若两个稀释度均在30－300则以其各自稀释度下计算的菌落数相除比值小于2则 取两稀释度的平均值如若大于2，则取稀释度小的那个计算菌落数。当然了，同一稀释度下的3个平皿自然是取3个平皿的均值。菌落计数：菌落数×稀释倍数 二 细菌的遗传与变异 细菌的变异现象 形态结构变异 抗原性变异 菌落的变异 毒力变异 耐药性变异 实验内容 细菌的变异现象观察 （1）H-O变异 （2）耐药性变异（示教） （3）菌落变异（示教） （4）L型细菌检测（示教） （5）细菌转化实验（示教） H-O变异 实验材料 1.菌种：变形杆菌 2.培养基：普通琼脂平板及0.1%石碳酸（各1） 实验方法：点种法， 37℃ 24h 培养。 实验结果记录：明天观察结果（迁徙现象） 耐药性变异（示教） 1. 什么是细菌的耐药性？耐药性变异机制是什么？ 2. 常见的耐药性细菌有哪些？ 3. 怎样检测耐药性？ 细菌耐药性的概念 可传递耐药性传播的三种结构形式：R质粒、转座子 和整合子。 细菌耐药的生化机制包括： ?钝化酶的产生 ?药物作用靶位的改变 ?抗菌药物的渗透障碍 ?主动外排机制 ?细菌自身代谢状态改变等 药敏试验 菌落变异（S-R变异）：石碳酸平板反复诱导(5-6次) L型细菌的检测：青霉素诱导 细小菌落 L型细菌的检测：青霉素诱导 细小菌落 1. 将金葡菌涂在L型固体培养基表面，贴苯唑青霉素药敏制片，37℃逐日培养，每天低倍显微镜下观察L型菌落 2. 革兰染色及细胞壁染色，观察细菌形态及细胞壁缺损 一 实验原理 转化（transformation）是指一段同源或异源的DNA转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程，是现代分子生物学研究和基因工程不可缺少的重要技术。目前常用的转化方法有CaCl2法(化学转化法)和电转化法。本实验是用pGLO细菌转化试剂盒中提供的pGLO质粒来转化大肠杆菌，所用方法为CaCl2转化法。 pGLO质粒上主要含有两个基因，一个为编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因，一个为抗生素氨苄青霉素抗性基因。此外，该质粒还整合有一个特殊的参与受体细胞中绿色荧光蛋白表达的基因调控体系，转化细胞中的绿色荧光蛋白基因只有在培养基中存在阿拉伯糖时才能启动表达。转化子细胞将在不含阿拉伯糖的培养基上呈白色而在含阿拉伯糖的培养基上显绿色荧光，这种荧光在长波紫外灯下即可观察到。 二 实验材料 受体菌：E.coli K12 HB101质粒：pGLO plasmid转化液（CaCl2）氨苄青霉素（amp）阿拉伯糖（ara）培养基：固体LB、液体LB 三 实验步骤 1. 准备平板： 每组：LB平板，LB/amp平板，LB/amp/ara平板2. 准备及活化感受态细胞：用250μl无菌水或转化液悬浮试剂盒中提供的大肠杆菌菌粉，此即感受态细胞。挑取1环E.coli K12 HB101菌液，于LB培养基上37℃活化16-24h。 　 3. 转化：1）在两只无菌离心管上分别标记+DNA, -DNA。2）在上述两管中分别加入250μl转化液。3) 迅速置于冰上。4）各挑取活化好的受体菌的一个单菌落，悬浮于两管转化液中。 5）在标有+DNA的管中加入一环质粒DNA，而标有