地高辛标记探针检测重组白细胞抑制因子-水蛭肽嵌合蛋白宿主dna .pdfVIP

66 中国医药生物技术 2014 年 2 月第 9 卷第 1 期 Chin Med Biotechnol, February 2014, Vol. 9, No.1 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.01.014 ·技术与方法· 地高辛标记探针检测 重组白细胞抑制因子-水蛭肽嵌合 蛋白宿主 DNA 残留量的研究 蔡晓娜，王鹏，贺晓强，刘立平，陈海容，郭晋霞，范开 重组白细胞抑制因子-水蛭肽嵌合蛋白（recombinant 用 100 μl 70% 的乙醇洗一次，风干后加 50 μl TE 缓冲液 neutrphil inhibitory factor and hirulog hybrid ，TNHH ）是一种 复溶上述沉淀即为纯化的探针。 通过基因工程技术改造的新型嵌合蛋白，临床上可用于急性 1.2.4 探针标记效率的检测 先将标记好的两组探针和地 脑栓塞后的脑组织损伤修复，减少脑水肿，防止微小血栓形 高辛标记对照探针稀释成 l ng/μl，再分别依次稀释至 10 、 成从而改善微循环，是一种有前景的心脑血管疾病治疗创新 3、1、0.3、0.1、0.03、0.01 pg/μl，分别取 1 μl 各浓度样品 药物，目前已进入临床 I 、II 期研究[1-2] 。由于在生产过程 点于尼龙膜上，经固定和封闭后，进行 Anti-DIG-AP 和 中使用了工程菌大肠杆菌，而宿主菌的残留 DNA 是重组 NBP/BCIP 显色反应。 药物中特有的潜在致癌性杂质，可能会随药物一同进入人体 1.2.5 供试液的制备 最终致癌，因此对 TNHH 原液中外源性 DNA 残留量的检 阳性标准品及供试品溶液、阳性样品的制备 [3] 测极为重要 。 ⑴阳性标准 DNA 溶液的制备：用 pH 8.0 的 TE 溶液 目前对重组生物制品的残留宿主 DNA 检测方法有多 稀释工程菌基因组 DNA 至 10 ng/μl，然后依次 10 倍稀释 种[4-6] ，与其他方法相比，地高辛标记探针杂交法具有灵敏 为 1 ng/μl、0.1 ng/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、0.1 pg/μl 。阴性对 度高、特异性强、对操作人员无放射危害等优点[7] 。本文采 照为 TE 溶液。 用分子杂交法，从小片段基因组 DNA 的制备、纯化、处 ⑵供试品溶液的制备：取 3 批 TNHH 原液，用 TE 溶 理、阳性样品的制备等方面进行优化，建立了 TNHH 制备 液将样品稀释至每 300 μl 含 4 mg TNHH （相当于临床最 过程中工程菌 DNA 残留的质控方法。 大剂量）用于点膜。 ⑶阳性样品的制备：取供试品 450 μl，加 10 ng/μl 标 1 材料与方法 准 DNA 溶液 1.5 μl，使其中含 1.5 ng 标准 DNA ，即与阳 1.1 材料 性标准 1 ng 对比。 TNHH 工程菌、TNHH 原液由重庆富进生物医药有限 样品处理 公司制备；地高辛标记和检测试剂盒购自美国罗氏公司；正 ⑴制备的阳性标准、供试品溶液及阳性样品不进行任何 电荷尼龙膜购自美国安玛西亚公司；细菌基因组 DNA