rPA（K）及其突变体表达系统的分析.pdfVIP

中文摘要 组织型纤溶酶原激活剂(tissue-typeactivator,t-PA)是人体内存在的多区域丝 plasminogen 氨酸蛋白酶，其在维持血流平衡、清除血液纤维蛋白方面具有重要的作刚。t-PA在溶解纤维 蛋白方面具有特异性，因此一经发现即铍用丁二血栓性疚病的治疗。但是bPA体内半衰期短， 只有3-5rain，临床治疗所需荆昔高达50-100 mg。火剂餐席．【{jt-PA不仅使患者经济负担沉重， 而且有颅内出血、周身纤溶性出血倾向笤副作用。为此，基丁对t-PA分子结构与功能的认识。 人们对t-PA分子进行改造，以延长其半衰期并增强纤溶活性。 本实验室李敏等人利用缺失／突变技术，获得了t-PA的缺失，点突变体rPA(KHRR296～ 同时去除了PAl-l(纤溶酶原激活剂抑制物一1)的结合位点，但rPA(g)表达体系仍存在一定缺陷： pErA(K)表达系统的目的蛋白以无活性包涵体的形式存在于胞质内，产物需经破碎细胞 才能提取，并要经过复性才具有生物活性；pCSRK表达产物目的蛋白的184位仍存在糖基化 位点，该糖基化位点的去除可能会进一步延长产物的半衰期，并增强其特异纤溶活性。 基予上述原因，本实验在前期工作的基础上，建立了rPA(K)的分泌型原核表达体系以 分离和纯化．并进～步降低研究成本，延长t-PA突变体的半衰期。具体研究内容如下； 1．用限制性内切酶NcoI，Xho I同时双酶切原核表达载体pErA(K)，获得了目的片段 pBrA(K)。 2．成功实现了分泌型原核表达载体pBrACK)的初步表达。SDS．PAGE结果表明，目的蛋 白含量占培养上清总蛋白的19．8％；ELISA结果显示，表达产物与抗t-PA抗体呈特异性阳性 反应，其平均含鼍为52ng／ml：纤维蛋白平扳检测表明，存在于培养液上清中的分泌蛋白勿需 复性即具有溶纤活性。 3．采用定点突变技术，对真核表达载体PCSRK上的目的片段rPA(K)进行了突变，获得 功去除了184位糖基化位点。 4．以腊质体LIPOFECTAMINETM2000 Reagent将含有目的片段rPA(KN)的真核表达载体 pCSRKN转染至COS-7细胞。纤维蛋白平板检测表明，表达产物具有良好的溶纤活性，从而 验证了PCSRKN在真核系统表达的可行性，并为下一步获得稳定表达新型t-PA突变体的细胞 克隆株奠定了坚实的基础。 关键词：组织型纤溶酶原激活荆，rPA(K)，rPA(KN) Ⅱ Abstract a in Tissue-typeplasminogenactivator(t-队)waskeyenzymefibrinolysissystem，the roleofwhich convert intoallactiveformofserine physiological wasto zymogenplasminogen theninitiatedoracceleratedthe of and the proteinaseplasmin，which processfibrinolysisdegraded networkofthrombi clots．Duetoits fibrinandactivation fibrin andblood fibrin hi曲a币n时for by was usedas theshorthalf-lifeoft-PA thatit binding，t-PAwidely throm