2灭菌方法培养基营养丰富，适合微生物生长，极易污染.PPT

第四章 植物组织培养的基本操作技术 1 器皿、工具的洗涤 要用洗涤剂去掉油脂和有机物；用1%左右的盐酸可将可溶性无机物洗去 洗液的配制 40克工业用重铬酸钾溶于加热100毫升水，冷却后慢慢加900毫升工业用浓硫酸，边加边搅拌，在玻璃缸或瓷缸中加盖备用。 2 灭菌方法 培养基营养丰富，适合微生物生长，极易污染，微生物生长大大快于植物学组织，大量消耗营养 为防止污染，应注意； 不与微生物或病理工作者共用组织培养工作区 一但发现污染，立即将污染的培养物拿出培养室进行灭菌处理 有菌的概念 凡是暴露在空气中未经处理的物体，曾经接触过自然水源的物体表面，都是有菌的 菌的特点是无处不在，无孔不入，在自然而然条件下忍耐力强。生活条件下要求简单，繁殖力强。 菌：包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物。这些生物个体极小，肉眼看不到。 无菌的概念 经过高温灼热或煮过足够长时间的物体，经其它物理或化学灭菌方法处理后的物体，有可能是无菌的。 高层大气、岩石内部、健康的植物动物内部不与外表面接触的组织内部有可能是无菌的 强酸强碱、化学灭菌剂等是无菌的 杀菌方法 物理方法：高温 湿热（121 1.1 15-20分钟 ） 和干热（160-180 2-3小时） 高压锅操作加水 放入物品 加热 排除冷空气 稳压 冷却 接种工具、瓶子、滤膜、针头、针管、容器等到可用这种方法 射线、超声波、微波、滤膜离心沉淀、大量无菌水反复冲洗等， 化学方法：各种化学药剂 双氧水、来苏水、升汞、新洁尔灭等 空气的过滤灭菌 超净工作台的工作原理就是通过不同等级的细菌过滤膜创造一个无菌的空间 液体的过滤灭菌 使用孔径0.45微米或更小的滤膜 1先对滤膜、细菌过滤器、无菌液收集容器等进行高温高压灭菌 2在超净工作台上等培养基冷却至40度左右时加入灭菌后的过滤液，混匀放置备用。 3不能在培养基温度较高时加入，防止不耐热物质的分解 接种用具的灭菌 接种服、帽子、口罩的灭菌 塑料器皿 的灭菌 3 植物材料的表面灭菌 接种就是将处理好的无菌的外植体经过无菌操作放置在灭过菌的培养基上过程 外植体的采集 刷洗 冲洗 表面灭菌 70%的酒精 穿透菌孢子的能力最强 表面活性剂1%吐温80或吐温20 或Triton-X 其它灭菌剂 灭菌剂对植物也是在毒的，要注意浓度和时间 表-1 常用外植体消毒剂的性质和消毒效果比较 茎尖、茎段或叶片 刷洗 2-10%次氯酸钠泡4-15分钟 无菌水冲洗2-3 果实、种子自来水冲洗10-20分 花药 70%酒精几秒 无菌水冲洗2-3次 10%漂白粉10分钟 无菌水冲洗2-3次 根及地下器官 难灭菌 的用0.1-0.2%的升汞或者1-2%的溴水 4无菌操作技术 提前准备工作 操作时的注意 外植体接种全过程： 酒精擦拭手 外植体消毒浸泡 器械消毒 酒精擦拭培养皿 取外植体 修剪外植体 旋转灼烧瓶口 接种 封口 5 组织培养中常见问题解决 （1）褐化 培养过程中细胞中多酚氧化酶激活后，酚类被氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性物质会扩散，使培养基变褐，还会抑制其它酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐死亡。 1.植物种类和品种 2.生理状态 处于幼龄期的植物材料较从成年植株采集的植物材料褐化程度轻；老熟组织较幼嫩组织褐化程度严重 。 处于生长季节的植物体内含有较多的酚类化合物，所以夏季时取材更容易发生褐化，冬春季节取材则材料褐化死亡率最低 3.培养基成份 无机盐浓度过高会使某些观赏植物的褐化程度增加；细胞分裂素水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐化现象加重。 4.培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速培养材料的褐化程度。 5.其它原因 防治措施 选择适宜的外植体和培养基 适当降低培养基的无机盐、降低PH值、降低细胞分裂素水平等 连续转移 加抗氧化剂，如抗坏血酸、硫代硫酸钠、牛血清蛋白、PVP（聚乙烯吡咯烷酮） 加活性炭 0.1-0.5% 加多胺类物质，如精胺、亚精胺 （2）玻璃化 组培苗含水量过高，茎叶呈透明状、叶片卷曲等到畸形，不能生根移栽 玻璃化苗的症状表现 试管苗矮小肿胀，失绿，茎叶表皮无蜡质层，无功能性气孔，叶、嫩梢呈水晶透明或半透明； 叶片皱缩并纵向卷曲，脆弱易碎； 组织发育不全或畸形；体内含水量高，干物质等含量低； 试管苗生长缓慢，分化能力下降，难以诱导生根，移栽成活率极低，因而繁殖系数低。 原因 植物种类 培养基硬度和离子比例 培养基中激素 CTK高 环境湿度 措施 适当控制培