实验细胞复苏与计数.docxVIP

细胞生物学实验细胞复苏及细胞鉴别与计数一、实验目的1、掌握细胞复苏的基本方法；2、掌握用血球计数板进行细胞计数的方法；3、学习死活细胞的鉴别方法；二、实验原理原理：是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。复苏细胞原则：快溶。防止在融化过程中已融解水渗透入细胞导致的二次结晶对细胞形成损害。使培养物能快速通过对细胞有损害的－5～0℃摄氏度区域，细胞仍能生长，活力受损不大。台盼蓝染色：台盼蓝(Trypan Blue)是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。依据此原理，细胞经台盼蓝染色后，可通过显微镜，直接镜下计数或拍照后计数，实现对细胞存活率比较精确的定量分析。细胞计数方法：血球计数板和显微镜智洁计数。血球计数板：由一块长约7.5cm，宽3.5cm的厚玻璃制成。计数室的边长为1mm，中间平台下陷0.1mm，盖上盖片后计数室的容积为 0.1mm3。所以，可根据在显微镜下观察到的细胞数目，换算成单位体积中细胞的数量。细胞计数：细胞压格计上线不计下，计左不计右，如有少量两个以上细胞按一个细胞计数，如超过10%说明消化不充分。实验步骤1、细胞复苏（1）准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯40℃的温水。（2）从液氮中取出冻存管、迅速置于温水不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分之内融化。取出冻存管，用75%的酒精擦拭管口。（3）将冻存管放入离心管中800r/pm离心10分钟，取出冻存管拿入超净台，75%酒精消毒管口，打开冻存管，弃掉上清液，沉淀加4ml的含10%FCS的DMEM培养基后吹打使细胞均匀，吸至一个25mL的细胞培养瓶中。（4）另取9滴细胞悬液加入1滴0.4%台盼蓝染色,取80μl细胞液镜下观察活力。2、细胞计数（1）检查记数板：在正式计数前，先用显微镜检查记数板的计数室，看其是否沾有杂质或干枯的菌体。若有污物，则需作以下几步清洗：擦洗 ：用药棉蘸取95%酒精，轻轻擦洗计数板的计数室。冲洗： 用蒸馏水冲洗计数板，并用毛边纸吸干其上的水分注意：勿用内火焰来烤干）最后用擦镜纸揩干净。镜检： 镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时，才可用于细胞的计数。（2）加样：先将盖玻片安放在计数室上面，然后摇匀样品取悬液，从盖玻片边缘滴加细胞悬液，连续2~3次，直至充满计数板和盖玻片间的空隙。（3）计数： 将加好样品的记数板置于显微镜载物台的中央，然后开始计数（4）清洗 ：计数完毕后，记数板先用95%酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，最后用擦镜纸揩干净。【注意】（1）计算计数板的四角大格内的细胞数，压线者只计算左侧和上方的，右和下不计算在内。（2）加液时勿使液体漫过盖玻片或出现气泡。（3）镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。（4）如细胞团占10%以上，说明消化不充分，（5）细胞数少于200个/10平方毫米或多于500个/10平方毫米时，均说明稀释不当，需重新置备细胞悬液，再重新记数。细胞存活率＝(细胞总数－蓝色细胞数)/细胞总数X100%实验结果1、复苏后的人宫颈癌Hela细胞（倒置显微镜20×）2、 表一：细胞计数结果活细胞数（个/mm3）死细胞数（个/mm3）方格一1237方格二13511方格三1047方格四1189方格五947方格六859方格七8710方格八6619总数81279平均值101.59.875细胞总数/ml:(101.5+9.875)×104 ×10/9=1.43×106 个/ml细胞存活率＝(细胞总数－蓝色细胞数)/细胞总数×100%=812/(812+79)×100%=91.1%实验结果分析1、由上表1可以看出根据结果可知，整体而言细胞液较为均匀，各个计数格间细胞数量差别不大，但是，仍然有个别数据偏离平均值较多。2、可能因镜检时间过长、因镜检而导致的细胞死亡数增多，导致死细胞的计数存在较大误差。六、实验思考题1、细胞计数应注意的问题？答：（1）计算计数板的四角大格内的细胞数，压线只计算左侧和上方的，右和下不计算在内。（2）加液时勿使液体漫过盖玻片或出现气泡。（3）镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。（4）如细胞团占10%以上，说明消化不充分，（5）细胞数少于200个/10平方毫米或多于500个/10平方毫米时，均说明稀释不当，需重新置备细胞悬液，再重新记数。2、检测细胞的死活还有哪些方法？(1 )染色法①亚甲基蓝溶液染色：亚甲基蓝为活体染色剂，可以让活细胞染色,死细胞不能染色。活细胞被染为深蓝色的部分是（细胞核）亚甲基蓝可