细胞培养专刊.doc

細胞培養常見問題解答 培養細胞的過程中充滿變數，當遇到問題時，常使得操作者很難發現徵結所在。然而，若是小心的檢視細胞的狀態及實驗的步驟，通常都可以找出問題所在。 在培養細胞時遇到的問題可歸納為下列幾點: 細胞長得不好 細胞形態不正常 以上問題可能發生的原因有: 培養細胞的環境錯誤 使用錯誤的培養基或培養基遭污染 細胞毒害,污染或養份不夠 培養細胞的技術不良或錯誤 檢視以上各點可以發現，正確且完整的實驗記錄是很重要的，其中必需包括 ： 培養的細胞株、接種的數量及密度、培養基及藥品，甚至是培養基及藥品的批號，如此在尋求問題解答時，才有正確的依據。 藥品 培養基： 使用正確的細胞培養基才可以使細胞正常的生長(若是對該使用何種培養基有問題，可以洽詢細胞株原供應者)。培養基若未能適當的保存或使用過期的培養基。則細胞無法正常生長。培養基應置放於2~8℃中黑暗保存，不正確的溫度或曝光都會引起培養基組成物質的分解，並可能會形成有毒物質。當發現培養基過期或呈混濁有沉澱時，應將之捨棄不用。在實驗室中以粉末配製液體培養基時，易因溶解不完全，pH值偏差，或水溫過高而導致錯誤。當液體培養基配好後，應以孔徑0.2mm，材質為cellulose acetate的濾膜將之過濾滅菌至一以滅菌之容器中。避免使用表面塗佈有濕潤劑的濾膜，否則可能會讓有細胞毒害的物質滲入培養基中。Nylon或玻璃材質的濾膜會過濾掉一些細胞生長所需的必需脂肪酸及脂質，nitrocellulose則會將蛋白質濾除，所以這些材質的濾膜應避免使用。已加入血清及其他生長因子的滅菌培養基不宜再過濾滅菌一次，而且，除非有特別註明,否則培養基不能高溫高壓滅菌。 　 添加物： 血清及L-glutamine是細胞培養基中最重要的二種添加物。處理血清時需非常謹慎，否則易造成污染或沉澱。若不得已使用不同種類或不同批號的血清來培養同一細胞株時，則細胞可能會有生長遲緩的情形發生。此外,使用缺少L-glutamine的培養基培養細胞也是常見錯誤之一。已加入L-glutamine的培養基在冷藏的環境之下可保存6~8週，欲長期使用時，需定期加入L-glutamine來維持培養基的效用。 　 容器： 培養細胞或配製藥品及培養基用的玻璃容器均需以phosphate-free(無磷酸鹽)的清潔劑清洗，並徹底沖洗乾淨，任何的殘留都有可能對細胞造成毒害。Spinner flask在經過一段時間的使用後，會殘留有一層細胞殘留物及界面活性劑，需將之取下，再塗佈一層矽化合物以減低剪力及磨擦力。重複使用的玻璃容器是內生性毒素(endotoxin)的來源，所以必須定期將容器以酸清洗或擺在烘箱中以乾熱法去除毒素。 　 培養環境 溫度： 溫度差異太大會嚴重影響細胞的生長。例如哺乳類動物細胞需養在37± 2℃，而昆蟲細胞則需培養在25± 2℃的環境中，如果超過此範圍則細胞容易死亡。 　 pH值： 絕大部份的細胞對其環境pH值相當敏感，過酸或過鹼都會使細胞生長不良或對細胞造成永久性傷害。大部份哺乳類動物細胞最適生長的pH值為7.4左右，而昆蟲細胞則為6.2。然而，培養環境的pH值會隨著營養 成份減少及呼吸作用產物的增加而改變，所以必須定時觀察培養環境的pH值變化。 　 二氧化碳： 哺乳類動物細胞培養基中含有緩衝物質，需要有二氧化碳的存在才能發揮緩衝作用。若是二氧化碳的量不足則易造成劇烈的pH值變化。通常大部份的培養系統中，5﹪的二氧化碳含量即已足夠。但是，隨著培養細胞株的不同，或欲促進細胞生長，需適當的調整二氧化碳的含量，並且在培養的過程中需將容器的蓋子稍為旋開以增加氣體交換速率。 昆蟲細胞培養基及某些哺乳類動物細胞培養基(如L-15)含有緩衝物質，並不依賴有二氧化碳才能發揮作用，所以，這類培養基在使用時，僅需放在正常的大氣環境中即可。 一般說來,含有Earle’s Balanced Salts的培養基需要有二氧化碳來使其發生緩衝效果，而含有Hanks’ Balanced Salts者則僅需置於正常大氣環境中。 　 濕度： 培養細胞的容器均需有可旋開的蓋子來進行氣體交換，而濕度也是維持的重要因子之一。濕度太低會使培養基水份蒸發太多，鹽濃度提高而細胞發生崩解。故在培養箱底部擺上一盆水可提供足夠的水份來維持濕度。 　 細胞 細胞毒性： 細胞毒性是指由於培養基中含有過量的物質或藥品抑制細胞的生長而言。細胞毒性會影響細胞的生長，最大的特徵是細胞形態發生變化：例如細胞變得巨大、細胞呈現多核狀、在細胞質或細胞核中有泡泡產生，以及細胞邊緣成破碎狀。 若想找出是什麼成份引起細胞毒性，可 以一次更換一種物質，觀察細胞培養時的形態直至找到為止。若是因為某種物質的濃度太高所致，則可以連續稀釋來測試出最適合的濃度。