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第13章 植物脱毒技术 引言 主要作物品种的病毒病防治和种质资源的安全保存是科研和生产上亟待解决的问题。 对病毒病防治存在一些困难：？ 应用组织培养技术获得无毒植株，进一步扩繁应用于生产，是目前最有效的防治病毒病的方法。 1 植物脱毒的意义 应用植物脱毒技术可使品种复壮，明显提高作物的产量、品质 促进活体植物材料的国际交换 应用植物脱毒技术可促进农产品的出口 还可增加社会就业机会 ★注意对“无病毒”植物一词的使用 2 植物脱毒的方法 2.1 物理方法 通过热处理（即热疗法）可由受侵染的个体得到无毒植株。 基本原理是：适当的高温可部分或完全钝化植物组织中的病毒，但很少或不伤害寄主组织（图10-1） 。 方法：热处理可通过热水或热空气进行，前者对休眠芽效果较好，后者对活跃生长的茎尖效果较好。 热空气处理的操作技术：把旺盛生长的植物移入热疗室中，35～40℃处理一定时间（几分钟到数周不等）。热处理后应立即把茎尖切下嫁接于无病砧木或进行组培。 局限：并非所有的病毒都对热处理敏感 注意：热处理的温度和持续时间十分重要 2.2 化学方法 生长调节物质 2-硫尿嘧啶 齿舌兰环斑病毒抗血清 Virazole（病毒唑） 放线菌酮和放线菌素－D 2.3 生物学方法 2.3.1茎尖组织培养脱毒法 （1）茎尖组织培养脱毒的机理 病毒在植物体内的分布是不均匀的，在茎尖中呈梯度分布。在受侵染的植株中，顶端分生组织无毒或含毒量极低，较老组织的含毒量随着与茎尖距离的加大而增加。因此采用茎尖培养的方法可以消除植物体内的病毒。 分生组织中含毒量低的可能原因： ①在植物体内，病毒可通过维管束组织系统长距离转移，转移速度较快，而分生组织中不存在维管束。②在旺盛分裂的细胞中，代谢活性很高，使病毒无法进行复制。③在植物体内可能存在着病毒钝化系统，它在分生组织中比其他任何区域具有更高的活性。④在茎尖中存在高水平内源生长素，可抑制病毒的增殖。 （2）外植体的选择 用组织培养法生产无病原菌植株，所用的外植体为茎尖或茎的顶端分生组织。顶端分生组织是指茎的最幼龄叶原基上方的部分，最大直径约为100μm，最大长度约为250μm。茎尖是指顶端分生组织及其下方的1～3个幼叶原基（图10－2）。 （3）操作方法 ①实验材料的获得 （预培养） ②实验材料的表面消毒 ③茎尖剥离 注意：切下的茎尖外植体不能与芽的较老部分或解剖镜台或持芽的镊子接触 （4）影响茎尖培养脱毒效果的因素 ①培养基 基本培养基： MS培养基适用于茎尖培养 p 230～231表12.1列举了几种用于栽培植物茎尖培养的培养基 培养基成分: 维生素和氨基酸：无严格估计 碳源：2％～4％蔗糖或葡萄糖 琼脂：常用琼脂培养基，也可用滤纸桥 植物生长调节物质：主要是生长素和细胞分裂素。①较大的茎尖外植体：可不用②分生组织： 有些植物只需生长素，有些二者皆需③赤霉素：对有些植物有用，对有的植物可能没用 ②外植体的大小 在最适培养条件下，外植体的大小决定茎尖外植体的存活率及脱毒效率。茎尖应小到足以根除病毒，大到足以发育成一个完整的植株（p232）。 叶原基的存在与否影响分生组织形成植株的能力。 重复切取茎尖培养也是一种获得无病毒苗的手段。 同一种病毒在不同植物体内分布部位不同，在用茎尖培养脱毒时，必须确定病毒在植物茎尖中的分布部位，然后确定培养茎尖的大小（如TMV）。最好找出茎原基所带叶原基的数目与生长点大小的关系。 不同病毒种类在同一种植物中分布部位不同，培养不同大小的茎尖外植体，所脱除的病毒种类不同（表13.1）。 ③培养条件 光照：在茎尖组织培养中，光照培养的效果常比暗培养好。某些植物茎尖培养的不同阶段对光的需求不同（马铃薯），有的需要一定时期的完全暗培养（天竺葵）。 温度：培养物通常都是放在标准的培养室温度下25℃±2℃。 ④外植体的生理状态 茎尖最好要由活跃生长的芽上切取 取芽的时间也是个重要因素 茎尖培养的效率取决于外植体的存活率、茎的发育程度、茎的生根能力及脱毒程度 2.3.2 愈伤组织培养脱毒法 原理：由受病毒侵染的组织形成的愈伤组织中的某些细胞不含病毒，由不含病毒的细胞可再生出无病毒植株 。 可能原因：病毒的复制速度落后于细胞的增殖速度；或有些细胞通过突变获得了抗病毒特性；或抗病毒侵染的细胞可能与敏感型细胞一起存在于母体组织中。例子： 烟草、马铃薯 问题：培养细胞在遗传上的不稳定性，以及某些农作物还不能由愈伤组织再生植株。 2.3.3 微体嫁接离体培养脱毒法 把极小（0.2mm）的茎尖接穗嫁接到实生苗砧木上（种子实生苗不带毒），然后连同砧木一起在培养基上培养。接穗在砧木的哺育下很容易成活，故可培养很小的茎尖，易于消除病毒。如苹果茎陷病毒（stem groovin