第二十章基因工程与分子生物学常用技术.docVIP

第章 基因工程与分子生物学常用技术 一、内容提要 基因工程是通过将目的基因在体外与基因载体重组，然后把它引入适当的宿主细胞中，随着该细胞的繁殖，DNA重组体得到扩增以及目的基因的表达，从而获得大量该基因编码的相应产物。这种含有单一DNA重组体的无性系称为克隆。将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白或多肽产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作统称为基因工程。 能够切割DNA多聚核苷酸链中磷酸二酯键的酶称为核酸酶，其中有选择地切割DNA分子特异序列的核酸酶，称为限制性核酸内切酶。 载体是为携带目的基因进入受体细胞进行扩增和表达的工具。常用载体有质粒、噬菌体、粘粒和病毒。 重组DNA技术的基本过程：①目的基因的制备：可通过基因组DNA文库、cDNA文库、PCR和化学合成等方法获取；②克隆载体的选择与构建；③目的基因与载体的连接：利用DNA连接酶将目的基因与载体DNA进行共价连接形成重组DNA分子；④重组DNA分子导入宿主细胞，导入的方法有转化和感染，随受体菌繁殖，重组DNA分子也得到扩增；⑤目的基因的筛选和鉴定：筛选含有目的基因的转化菌并加以扩增。筛选的方法有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等；⑥克隆基因的表达：包括原核表达和真核表达两种体系。可制备特定的蛋白质或多肽。 基因诊断是以DNA和RNA为诊断材料，DNA反映基因的存在状态，RNA反映了基因的表达状态，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。基因诊断的常用技术方法包括核酸分子杂交、PCR、单链构象多态性、限制性内切酶酶谱分析、DNA序列测定和DNA芯片技术等。 基因治疗是指以正常基因矫正、替代缺陷基因，或从基因水平调控细胞中缺陷基因的表达的一种治疗疾病的方法。基因治疗的基本程序包括：①选择和制备目的基因；②选择基因转运载体；③选择靶细胞；④转移基因。基因治疗的基本策略包括：①基因增补；②基因置换；④基因失活；⑤基因疫苗。 核酸分子杂交是依据两条核酸单链之间碱基互补、变性和复性的原理，用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针，检测待测样品中是否存在与其互补的同源核苷酸序列的方法。杂交的双方分别称为探针与待测核酸，杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。核酸分子杂交的类型有Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、斑点及狭缝印迹杂交和原位杂交等。 聚合酶链反应是一项体外快速的，有引物介导的特定DNA序列扩增技术。PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与DNA模板两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性→复性→延伸三个基本反应步骤构成一个循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，使DNA得以扩增。 核酸序列分析技术建立在化学裂解法以及F.Sanger的DNA链末端合成终止法的基础上。目前DNA自动测序已经完全取代手工操作，采用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳分离后，用激光激发DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 基因文库可分为基因组DNA文库和cDNA文库。基因组DNA文库是以DNA片段形式存在的某一生物体的全部基因组DNA（包括所有的编码区和非编码区）信息；cDNA 文库是指某一组织细胞所表达的全部mRNA 经逆转录形成的cDNA 片段与载体连接而形成的克隆集合，特点是其中不含有非编码区。 生物芯片分为基因芯片、蛋白质芯片以及其它芯片三类。其中，基因芯片是一种快速、高效的核酸分析手段，原理与传统的核酸分子杂交相似，应用于基因表达的研究。涉及基因功能分析、疾病发生机制探讨等；蛋白质芯片利用蛋白质间的相互作用，如抗原-抗体反应或受体-配体之间的特异作用来进行检测，应用于蛋白质功能、蛋白质相互作用研究等。 蛋白质相互作用的研究技术有：酵母双杂交、标签蛋白沉淀、噬菌体显示系统筛选等。其中，酵母双杂交技术是以酵母作为真核蛋白相互作用的模型，通过检测报告基因的表达产物就可判断两种蛋白是否发生相互作用。蛋白质与DNA相互作用是基因表达及其调控的基本机制。电泳迁移率实验（EMSA）与染色质免疫沉淀分析是目前常用于分析蛋白质与DNA相互作用的方法。 二、学习要求 （一）基因工程 掌握基因工程的基本概念；熟悉工具酶和载体。 （二）重组DNA技术的原理和过程 掌握克隆、重组DNA技术、基因文库、cDNA文库、转化和感染的概念；熟悉重组DNA技术的基本过程。 （三）基因诊断和基因治疗 掌握基因诊断和基因治疗的概念。熟悉基因治疗的基本策略基本程序。 （四）核酸分子杂交技术 熟悉核酸分子杂交的基本概念和基本原理。了解核酸分子杂交的基本方法及其应用。 （五）聚合酶链反应 掌握PCR的基本概念和原理。了解P