EASYspinPlus大量植物RNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书.doc

EASYspin Plus大量植物RNA快速提取试剂盒 目录号：目录编号 包装单位 01 10次 适用范围： 适用于快速提取植物组织细胞总RNA试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成 保存 0次 裂解液RLT室温 0 ml 裂解液RLT室温 0 ml 去蛋白液RW1 室温 0 ml 漂洗液RW 室温 ml X 2第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free H2O 室温 10 ml PLANTaid 室温 ml 基因组DNA清除柱 和收集管 室温 0套 RNase-free 吸附柱RA和收集管 室温 0套 本试剂盒在室温储存个月不影响使用效果。储存事项： 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。 不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。 注意事项 所有的离心步骤均在室温完成，使用离心机。 需要自备乙醇，一次性注射器（可选），研钵。 裂解液RLT Plus和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时用大量清水或者生理盐水冲洗。 关于DNA 的微量残留: 一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留,本公司的EASYspin系列RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大, 如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时： 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。 将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup),请联系我们索取具体操作说明书。 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。 RNA 纯度及浓度检测: 完整性： RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb，分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。 纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。 浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 提示： 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇! 直接研磨法: a. 新鲜植物组织称重后取1g迅速剪成小块放入研钵放入研钵， 加入10体积（1ml）RLT和1体积（1l） PLANTaid 室温下充分研磨，注意应该迅速研磨让组织和裂解液RLT立刻充分接触以抑制RNA酶活性。b. 将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，,000-13,000x g离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid，取裂解物上清转到一个新离心管。 c. 加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即混匀，不要离心。 d. 立刻接操作步骤项下3。液氮研磨法: a. 取l裂解液RLT，转入ml离心管中，加入l PLANTaid混匀备用。 b. 液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取细粉转入上述装有RLT和PLANTaid的离心管, 立即剧烈。 在56℃温育1-3分钟有助于